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胆固醇是昆虫的必需营养物质,在昆虫中行使两个重要功能:一是细胞膜主要组成成分,对细胞膜稳定性起重要作用;二是甾醇类激素(如蜕皮激素)的前体物质。不同于哺乳动物,昆虫不能合成胆固醇,只能从食物中获取该营养。植物胆固醇含量极低,主要以植物固醇为主,植食性昆虫需将植物固醇通过脱烷基反应代谢为胆固醇,才能加以利用。因此,昆虫中参与吸收转运植物固醇和代谢植物固醇为胆固醇的基因尤为关键。若以固醇吸收或代谢的相关基因为靶标,阻碍昆虫对固醇的获取或转化,导致昆虫不能完成生长发育。这作为害虫防治的一种策略具有重要的应用价值。然而,昆虫参与固醇吸收和转运的基因研究较少,相关功能也鲜见报道。因此,本论文主要进行如下两方面的研究工作:1)鉴定昆虫中参与肠道固醇吸收基因并分析系统发育。以棉铃虫为主要研究对象,利用荧光定量PCR、荧光原位杂交、CRISPR/Cas9以及气质联用质谱分析(GC-MS)等技术手段分析了相关基因的功能;2)利用高通量测序数据挖掘棉铃虫体内参与代谢植物固醇的基因,并通过CRISPR/Cas9及气质联用等手段分析候选基因的功能。主要研究内容如下:1)NPC1蛋白在昆虫中的进化关系未知。本研究利用已有高通量测序数据鉴定10个目中39种昆虫NPC1基因;其中30个物种含有两个NPC1基因(NPC1a和NPC1b),NPC1基因的分化起始于昆虫祖先。有9个物种发生NPC1丢失现象,即只含有一个NPC1基因,主要发生在半翅目的胸喙亚目。此外,本论文所鉴定的NPC1a均含有内含子,但是鳞翅目昆虫NPC1b均没有内含子,而其它物种NPC1b均有内含子。NPC1在昆虫中保守,可能行使相同功能。2)已知果蝇中NPC1b参与肠道吸收固醇营养过程,NPC1a为细胞内运输固醇功能,但两个蛋白在棉铃虫中研究未见报道,功能是否保守未知。因此,本研究以棉铃虫为研究对象,探究NPC1s表达特点并主要验证了NPC1b肠道吸收固醇功能。棉铃虫NPC1a和NPC1b功能时空表达模式截然不同:NPC1a在不同组织和龄期中均广泛表达;而NPC1b为昆虫中肠高表达,后肠不表达,其它组织表达相对很低。荧光定量分析发现,NPC1b在幼虫取食期高表达,在卵和蛹期相对表达较低。幼虫期的取食行为或含低浓度胆固醇的饲料均会上调NPC1b表达。通过模拟NPC1b_N蛋白模型以及同小分子对接,得到同固醇分子作用的10个作用位点(Gln73、Asn106、Lys76、Phe98、Ile102、Met105、Met164、Leu188、Ala189和Pro190),6个位点在鳞翅目中完全一致,其中包括与人类NPC1和NPC1L1蛋白保守的Gln73和Pro190。Gln73为NPC1b_N同胆固醇羟基作用的重要氨基酸位点。人类的NPC1抑制剂(ezetimibe和U18666A)对棉铃虫NPC1s没有抑制效果。使用CRISPR/Cas9技术成功大片段敲除棉铃虫NPC1b基因后,棉铃虫幼虫无法生长到2龄。分析了棉铃虫不同卵龄及不同sgRNA浓度对敲除效率的影响:注射4小时内产的卵敲除效率高,但注射2.5小时以内产的卵则胚胎死亡率较高;使用50 ng/μl和100 ng/μl sgRNA的剂量在同一卵龄产生的敲除效果相同。最终,我们得出NPC1b是棉铃虫肠道吸收固醇关键基因。3)flotillin在人类中报道同固醇吸收蛋白NPC1L1互作转运胆固醇分子,昆虫中对此蛋白研究较少,蛋白功能是否保守也未知。本研究分析23个昆虫物种的基因组发现,flotillin蛋白存在于所有23个物种并分为两个蛋白家族:flotillin-1和flotillin-2。通过多序列比对分析,确认昆虫flotillin蛋白家族保守特征序列以及flotillin-1和flotillin-2各自特有的保守序列信息,这些特征序列可以快速的鉴定昆虫flotillin蛋白。flotillin-2敲除成功后,降低棉铃虫对胆固醇的吸收效率,推测可能参与了肠道对固醇吸收转运过程。这是在昆虫中首次对flotillin蛋白进化及关于固醇吸收的相关研究。4)前人研究表明在包括棉铃虫在内的多种昆虫中,SCP-X蛋白肠道高表达,参与肠道固醇吸收。SCP2保守结构域是SCP-X蛋白的功能域,行使固醇转运功能。因此我们分析了10个昆虫物种的基因组发现,含SCP2结构域的蛋白序列可分为SCP-X、SCP-2l、MFE2和HSDL2四个蛋白家族。所有昆虫都含有一个MFE2、HSDL2和SCP-X蛋白,但是SCP-2l蛋白仅存在于鳞翅目和双翅目中。埃及伊蚊中SCP-2l基因在中肠高表达且可能具有固醇转运功能。我们发现棉铃虫SCP2-2l不在中肠中高表达,因此推测SCP-2l基因可能不参与肠道吸收固醇的转运过程。而棉铃虫SCP-X在中肠高表达,应该参与了固醇吸收途径,且结合前人研究鉴定4个同胆固醇结合的保守位点,为抑制剂的开发提供参考。5)植食性昆虫不能直接利用植物固醇,需要将植物中的植物固醇代谢为胆固醇加以利用,而参与昆虫代谢植物固醇的基因未知。本研究利用二代转录组测序技术鉴定378个可能参与代谢植物固醇谷固醇为胆固醇的差异基因,其中有80个已经注释为lncRNA。我们对378个差异基因进行GO富集分析,并通过蛋白组鉴定蛋白是否真实表达,并以是否在中肠高表达为条件,筛选出7个参与代谢植物固醇的候选基因。4个候选基因敲除成功后,棉铃虫对谷甾醇的代谢效率下降。