研究背景主动脉夹层/瘤(AD/AA)是指由于内膜局部撕裂并逐步剥离、扩展,在动脉内形成真、假两腔,最终导致主动脉扩张甚至是破裂的疾病。AD/AA发生初期,大量炎症细胞如中性粒细胞及巨噬细胞浸润,分泌炎症因子和基质蛋白酶,导致弹力纤维断裂、平滑肌细胞凋亡以及胶原降解等血管损伤反应;而随着疾病的发生发展,一方面,血管外膜的成纤维细胞被激活和分泌的细胞外基质(ECM)增加;另一方面,炎症反应阶段浸润到外膜的促炎型巨噬细胞失活并向分泌胶原的修复型转化。这两方面共同促进了血管的修复,阻止血管扩张甚至是破裂。前期研究发现,在AD/AA的患者和动物中,血清和血管组织中LCN2的水平显著升高,且主要由成纤维细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞分泌,提示LCN2参与AD/AA的发生发展过程。但是,LCN2是如何调节AD/AA发生发展的具体作用和机制并不清楚。血管外膜沉积的ECM是在主动脉夹层/瘤发生发展之后挽救血管扩张甚至是破裂的最后防线,所以促进ECM的沉积是挽救患者血管破裂一种很重要的治疗策略。因此,对ECM生成中的成纤维细胞的反应和对巨噬细胞表型转化的全面了解在预防和治疗AD/AA中是至关重要的。LCN2可通过分泌胶原促进醛固酮/盐皮质激素受体介导的血管纤维化以及在感染性疾病中促进巨噬细胞向抑炎表型转化。但是,LCN2在AD/AA发生发展过程中对ECM的沉积和巨噬细胞表型的影响所发挥的具体作用和机制并不清楚。我们提出假说:AD/AA通过刺激血管组织中LCN2的表达,调控ECM和炎症相关的基因的表达,参与影响血管损伤及修复的过程。在AD/AA发生发展过程中,LCN2的缺失将抑制血管外膜成纤维细胞分泌ECM相关分子和促进巨噬细胞向促炎型转化,并最终影响血管损伤和修复过程。本研究以LCN2基因敲除小鼠为研究对象,关注AD/AA发生发展过程中血管的损伤和修复,探究成纤维细胞分泌ECM以及巨噬细胞表型转化这些核心环节,为探明AD/AA导致的血管扩张甚至是破裂的病理机制提供实验和理论依据。研究目的本研究以野生型和LCN2基因敲除型小鼠行β-氨基丙腈喂水(BAPN)以及血管紧张素II(A II)复制主动脉夹层/瘤模型,我们探讨了主动脉夹层/瘤过程中LCN2的表达情况;利用LCN2基因敲除型小鼠和注射重组LCN2蛋白,正反两方面研究在LCN2缺失或存在的情况下,对主动脉夹层/瘤发生发展的促进或是保护作用;利用RNASeq的方法,证实LCN2缺失对主动脉夹层/瘤发生发展过程中细胞外基质沉积的影响;利用病理染色、q RT-PCR方法观察细胞外基质沉积的情况,明确LCN2的促血管外膜细胞外基质沉积的作用。此外,利用胰蛋白酶灌注造成腹主动脉瘤模型,观察LCN2对腹主动脉瘤中巨噬细胞表型转化的影响,病理染色及q RT-PCR的方法观察血管损伤处巨噬细胞相关炎症因子的浸润及表达,明确LCN2对腹主动脉瘤中巨噬细胞表型的影响,最终为临床主动脉夹层/瘤患者提供潜在的干预靶点。第一部分脂质运载蛋白2通过促进Collagen I/Tnc抑制BAPN/A II和A II所致主动脉夹层/瘤方法1、研究对象分组:实验动物雄性野生型C57BL/6J小鼠77只,LCN2基因敲除型小鼠41只,均随机分组。(1)BAPN/A II模型:17只野生型和17只LCN2基因敲除型小鼠随机分组(普通水组n=6;BAPN组n=11),野生型小鼠喂普通水组;野生型小鼠喂BAPN组;LCN2基因敲除型小鼠喂普通水组;LCN2基因敲除型小鼠喂BAPN组,喂β-氨基丙腈4周后血管紧张素灌注24小时。再另外随机选取12只野生型小鼠用于提取血管成纤维细胞用于细胞实验。(2)A II模型:12只野生型和12只LCN2基因敲除型小鼠随机分组(n=6),野生型小鼠灌生理盐水组;野生型小鼠灌A II组;LCN2基因敲除型小鼠灌生理盐水组;LCN2基因敲除型小鼠灌A II组。(3)LCN2重组蛋白体内打药实验:12只LCN2基因敲除型小鼠随机分组(n=6),LCN2基因敲除型小鼠灌生理盐水组;LCN2基因敲除型小鼠LCN2重组蛋白注射组。2、主动脉夹层/瘤模型制作:(1)BAPN/A II模型:C57BL/6小鼠,雄性,3周龄,正常饮食,自由饮水,饮用水中加入BAPN药物(0.3g/100m L水),连续4周;对照组正常饮食,自由饮水,引用正常饮用水。喂BAPN 4周后A II(浓度为500ng/kg.min)灌注24小时。(2)A II模型:C57BL/6小鼠,雄性,6-8周龄,右耳后皮肤消毒,剪开一小口,用血管钳从小口伸入皮下,将皮肤与皮下组织钝性分离,灌着A II(浓度为1500ng/kg.min)的泵顺着小口插入(泵针孔方向朝着鼠尾端,),最后缝合皮肤剪口。3、主动脉夹层/瘤后LCN2的表达:Real-time PCR,ELISA和免疫组化法检测。4、血管直径的测定和弹力纤维断裂程度的分级:采用弹力纤维(VVG)染色检测血管的直径和弹力纤维的断裂程度。5、血管外膜细胞外基质沉积检测:采用天狼星红染色法检测外膜胶原沉积。6、血管外膜细胞外基质相关分子基因表达检测:采用免疫组织化学染色,Western Blot蛋白免疫印迹和实时荧光定量的方法检测细胞外基质相关分子基因的表达。7、体外检测重组LCN2对成纤维细胞中胶原相关分子的表达:提取小鼠成纤维细胞,培养至第3-4代时,给予重组的LCN2刺激,提取RNA,用Real-time PCR和Western Blot蛋白免疫印迹检测成纤维细胞中胶原相关分子的表达。8、统计方法:应用SPSS13.0统计软件进行实验数据处理。计量资料以均数±标准差表示,符合正态分布的计量资料两组间比较采用成组t检验。组内各观察点间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1、主动脉夹层/瘤发生发展后,野生小鼠血管组织和血清中,在RNA和蛋白水平LCN2的表达均增高;2、主动脉夹层/瘤的小鼠血管组织浸润的LCN2主要由浸润的炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)以及成纤维细胞分泌;3、主动脉夹层/瘤发生发展后,与野生型小鼠组相比,LCN2敲除型小鼠的存活率降低,主动脉夹层/瘤发生率增高;4、主动脉夹层/瘤发生发展后,与野生型小鼠组相比,LCN2敲除型小鼠的血管直径和弹力纤维断裂紊乱程度增高;5、主动脉夹层/瘤发生发展后,与野生型小鼠组相比,LCN2敲除型小鼠的血管外膜细胞外基质沉积减少;6、在野生型和LCN2敲除型小鼠发生主动脉夹层/瘤的血管组织中提取RNA,进行RNA-sequencing(RNA测序),用GO分析方法来分析这些差异表达的基因发现,细胞外基质相关的因子差异最大;7、检测主动脉夹层/瘤后野生型和敲除型小鼠血管组织中细胞外基质相关因子的表达,敲除组的细胞外基质相关因子下降;8、利用天狼星红染色方法检测主动脉夹层/瘤后野生型和敲除型小鼠的血管组织外膜细胞外基质沉积情况,敲除组的细胞外基质沉积减少;9、利用免疫组织化学染色方法检测主动脉夹层/瘤后野生型和敲除型小鼠的血管组织中Collagen I/Tnc的表达,敲除组的表达减少;10、提取野生型小鼠的成纤维细胞,体外给于重组LCN2刺激,与未处理组相比,LCN2组可促进成纤维细胞分泌细胞外基质相关因子;11、LCN2敲除型小鼠自开始喂BAPN第一天开始,每隔一天直至造模结束分别进行腹腔注射生理盐水和重组LCN2,与对照组相比,重组蛋白组的存活率和血管外膜细胞外基质沉积增高、动脉夹层/瘤发生率和血管直径下降。第二部分脂质运载蛋白2对小鼠腹主动脉瘤巨噬细胞表型转化的调节方法1、研究对象分组:采用胰蛋白酶灌注肾下腹主动脉建立腹主动脉瘤小鼠模型,实验动物雄性野生型C57BL/6J小鼠16只,LCN2基因敲除型小鼠16只,均随机分为2组(n=10)。实验分组如下:野生型弹力蛋白酶灌注组;LCN2基因敲除型弹力蛋白酶灌注组。剩余6只野生型小鼠和6只LCN2基因敲除型小鼠分别用于提取骨髓单核巨噬细胞。2、小鼠骨髓单核巨噬细胞的培养:采用淋巴细胞分离液培养巨噬细胞。3、腹主动脉瘤模型制作:老鼠(8周)用2%异氟烷吸入麻醉,在外科立体显微镜下执行剖腹手术,分离左肾静脉水平到髂分支水平段的腹主动脉,暂时结扎两端点。给腹主动脉切开一小切口,抽掉其中的血液,通过切开的小口插入主动脉,分别给予生理盐水(对照组)或者猪胰蛋白酶灌注(比活度6 U/mg;美国Sigma公司)(弹力蛋白酶灌注组),然后缝合切口,移除结扎线,确认主动脉的血流恢复,关闭腹腔。手术后14天,所有老鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪(100mg/kg,10mg/kg)混合麻醉,颈椎脱位法处死。在麻醉和生理血压的条件下测定小鼠灌注前后的血管直径,灌注后较灌注前相比较血管扩张≥100%。主动脉组织样本得到进行组织学分析。4、血管和巨噬细胞相关炎症因子的检测:采用免疫组织化学染色和实时荧光定量检测血管及巨噬细胞相关炎症因子产生;5、血清和细胞上清炎症因子检测:收集血清和细胞培养上清于EP管中。使用小鼠ELISA检测试剂盒检测上清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-10的水平。6、统计方法:同第一部分。结果1、LCN2抑制胰蛋白酶诱导的腹主动脉瘤血管外膜中巨噬细胞向促炎表型(M1)转化;2、分别给予野生型巨噬细胞和LCN2基因敲除型巨噬细胞LPS,6h后小鼠细胞和细胞上清中的M1型巨噬细胞标志物IL-1β,IL-6,TNF-a,MCP-1明显增多,而M2型巨噬细胞标志物IL-10明显降低;3、体外培养骨髓单核巨噬细胞,给予重组LCN2后可以明显抑制巨噬细胞M1型促炎因子的产生,而促进其M2型抑炎因子的产生。结论1、在主动脉夹层/瘤的模型中,LCN2表达上调,并且LCN2是浸润到血管外膜中的炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)以及成纤维细胞分泌的;2、在主动脉夹层/瘤的模型中,与野生型小鼠相比,LCN2基因敲除型小鼠的存活率下降,血管直径和弹力纤维断裂紊乱程度增高,LCN2参与主动脉夹层/瘤的病理过程;3、RNA转录组测序和q RT-PCR分析显示,LCN2基因敲除型小鼠的血管与野生型小鼠相比,显示不同的转录特性,显示出抑制细胞外基质沉积的特性;4、LCN2的重组蛋白促进主动脉夹层/瘤发生发展时血管外膜细胞外基质沉积。5、LCN2还可以通过抑制巨噬细胞向促炎型转化而参与主动脉瘤的发生发展。综上所述,本研究结果表明,AD/AA激活浸润到血管外膜中炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)以及血管壁外膜成纤维细胞,表达LCN2增多。应用LCN2的敲除鼠,证明了LCN2的缺失可以加速AD/AA后的发生发展,存活率降低,血管直径和弹力纤维断裂紊乱程度增高以及血管外膜细胞外基质沉积减少。补充LCN2重组蛋白后,AD/AA后的血管外膜的细胞外基质沉积得到改善。LCN2的这种保护AD/AA发生发展的作用是通过上调AD/AA后成纤维细胞的细胞外基质相关因子的表达以及抑制巨噬细胞向促炎的M1型转化实现的。本研究首次证明AD/AA激活浸润到血管外膜中的炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)以及血管壁外膜成纤维细胞分泌LCN2,进而LCN2促进成纤维细胞分泌细胞外基质相关因子以及抑制巨噬细胞向促炎的M1型转化,从而抑制AD/AA的发生发展和血管损伤。本研究提供新颖的体内和体外的证据,表明通过调控LCN2的表达可能成为AD/AA发生发展新的干预靶点。