鸭瘟病毒UL22基因的多抗制备、细胞内定位及真核表达研究

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cheayu123
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本研究对DPV UL22基因进行了分子特性分析、克隆、原核表达、蛋白纯化、多克隆抗体的制备、细胞内的定位及真核表达研究,获如下结果:1.鸭瘟病毒UL22基因的生物信息学分析通过生物信息学分析工具对UL22基因核苷酸序列、编码蛋白gH及与其它疱疹病毒的同源性作了分析。结果表明UL22基因为2505bp,分子量92.5433kDa,编码834个氨基酸,有一条信号肽和两个跨膜区,还含有8个N-糖基化位点和52个潜在的磷酸化位点,抗原位点较多,gH蛋白的分子之间形成了三个二硫键。同源性分析表明gH蛋白在疱疹病毒中是非常保守的,且与马立克病毒属的MeHV-1.GaHV-2和GaHV-3 UL22基因的同源性最高。2.鸭瘟病毒截段基因的原核表达及抗体的制备根据生物信息学预测结果,去除掉gH蛋白的信号肽和跨膜区得到了截段形式的gHt基因,构建了原核表达重组质粒pET32c(+)-gHt,转化到宿主菌BL21后在37℃、0.2mmol/L IPTG及10h诱导条件下,得到gHt蛋白,该蛋白主要存在于包涵体。纯化的gHt蛋白免疫兔子制备的高免血清效价达到1:32,Western blot证实gHt蛋白可被兔抗DPV血清识别。3.鸭瘟病毒糖蛋白gH的细胞内定位采用间接免疫荧光实验来检测DPV gH蛋白在感染细胞内的表达和定位,实验结果表明gH蛋白主要存在于细胞质中,与生物信息学预测结果一致。gH蛋白在病毒感染6h开始表达,在30-43h表达量达到最大。4.鸭瘟病毒UL22基因真核表达载体的构建及蛋白表达情况对已构建成功的T克隆质粒pMD20T-gH和pMD19T-gHt双酶切,然后与真核表达载体pCMV-HA连接,构建了重组真核表达质粒pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt.重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000转染HEK293细胞,利用RT-PCR、间接免疫荧光试验分析gH和gHt蛋白在HEK293细胞的表达情况,结果表明pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt在HEK293细胞中的表达量较高,且也同样位于细胞质,这些结果为稳定表达DPV gH蛋白细胞系的构建提供基础。
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