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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起感染猪表现为呕吐、发热、脱水、严重腹泻的一种高度接触性肠道传染病,发病主要集中在冬季,可感染各阶段猪,但以哺乳仔猪发病和病死率最高,可达100%,给全世界养猪业造成巨大经济损失。目前没有有效的防控措施,有研究表明,接种过疫苗的猪群照样有暴发PED的情况,到2010年这一现象更为严重。因此,建立检测PEDV抗体水平的诊断方法很有必要。本试验对PEDV N基因进行了克隆和原核表达,用纯化重组N蛋白为包被抗原,建立了PEDV血清抗体水平间接ELISA检测方法并初步应用于临床,获得如下研究结果:1.采集陕西省部分地区猪场疑似感染PEDV死亡的猪小肠样品5份,用RT-PCR扩增5份样品的N、S和M基因,分别命名为1-SL、2-BJ、3-YL、4-WN和5-HZ。同源性比较分析,本省流行的5个毒株与中国现用疫苗株CV777的S、M和N基因中S基因同源相似性最低,核苷酸相似性为94.9%~99.2%,氨基酸序列相似性为94.9%~99.7%,其次是N基因,核苷酸同源相似性为95.1%~99.9%,氨基酸序列相似性为96.2%~100%,M基因同源相似性最高,氨基酸序列相似性为96.2%~100%;遗传进化树分析,5个毒株的S、M和N基因均与疫苗株CV777遗传亲缘关系相对较远;同一省份不同地区5株流行株的不同基因遗传亲缘远近不一样。2.设计N基因的一对特异性引物,提取病毒RNA,以HiScript?Q RT SuperMix for qPCR说明书反转录的cDNA为模版,PCR扩增和核酸胶回收目的基因,克隆N基因并原核表达,重组质粒pET-28a-N转化至大肠埃希菌BL21。重组蛋白分子质量约58 kD,SDS-PAGE分析为可溶性蛋白。用优质镍柱纯化裂解上清液,获得量大、纯度较高的蛋白,Western blot分析与PEDV阳性血清有良好的特异反应性。用纯化N蛋白为包被抗原,ELISA检测最优条件为:抗原包被量每孔0.5μg/mL,血清以1:200倍稀释作用1.0h,酶标二抗以1:5000稀释作用1.0 h,TMB显色时间25 min。敏感性、特异性、重复性检测均良好,初步检测临床164份血清,效果较好。