胰腺癌是一种恶性度极高的肿瘤,其发病隐匿、高度侵袭、化疗耐药的特点对临床的诊断及治疗都造成了极大困难。虽然过去几十年有诸多研究者致力于胰腺癌发病机制及治疗措施的研究,但目前胰腺癌的5年生存率仍低于5%,手术切除率低于20%,单药或联合用药化疗都没有显著的效果,因此对胰腺癌的发生发展机制及生物学指标的研究具有重要的意义。microRNAs是近年来的研究热点,其最早发现于线虫对生物学功能的时序性调节。microRNAs的成熟序列由18-25个核苷酸组成,进化上高度保守,其5’端是一段2-8nt的“种子”序列,可与特定mRNA的3’UTR互补结合,进而在RNA诱导的基因沉默复合物的作用下,导致靶基因的翻译抑制或降解,实现基因转录后水平的直接调节。广泛的研究表明microRNAs在肿瘤的发生发展中也发挥着重要作用。本课题组之前对胰腺癌中的microRNAs进行了初步探讨,发现了差异表达的microRNAs并对其生物学功能进行了相应研究。本研究是在课题组前期实验结果的基础上,对miR-30b在胰腺癌中作用进行初次探索。首先,利用人胰腺癌细胞系PANC-1、MIA PaCa-2、BxPC-3和AsPC-1,通过实时定量PCR的方法检测了miR-30b的内源性表达,以正常胰腺组织作为对照,发现4种细胞系中miR-30b均呈低表达,并且以PANC-1和MIA PaCa-2的表达最低,因此选取这两种细胞系作为本课题的研究模型。进而,在12对胰腺癌肿瘤／配对正常组织的新鲜标本中检测miR-30b是否存在差异表达,实时定量PCR的结果显示,与对照组相比肿瘤组织中均表现为miR-30b表达。miR-30b的表达差异提示其在胰腺癌的发生发展中可能发挥肿瘤调节作用。进一步,本课题对胰腺癌中miR-30b的生物学功能进行了相应研究。在PANC-1和MIA PaCa-2细胞系中转染miR-30b mimics,使细胞中miR-30b过表达,CCK-8检测细胞活性,软琼脂集落形成实验和EdU免疫荧光染色法检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC染色后流式细胞仪检测细胞早期凋亡率,PI染色后流式细胞仪检测细胞周期改变,划痕实验检测细胞迁移能力,transwell实验检测细胞侵袭能力。结果发现肿瘤细胞过表达miR-30b后,细胞成活率降低,集落形成能力明显下降,细胞的增殖能力明显低于对照组,细胞早期凋亡率升高,S期细胞数量减少,细胞阻滞于G0/G1期,并且细胞的迁移及侵袭能力也受到抑制。然后,我们对miR-30b发挥作用的分子机制进行了探讨。利用生物信息学预测软件预测miR-30b可能的靶基因,并与已有的文献报道相关联,寻找胰腺癌中可能发挥作用的基因,结果TargetScan和PicTar等多个软件皆预测到KRAS为miR-30b的靶基因。进一步我们构建了包含miR-30b结合位点的KRAS-3’UTR表达载体,并在胰腺癌细胞中过表达miR-30b后提取细胞蛋白,通过双荧光素酶报告基因实验和western blot验证了KRAS是miR-30b的直接靶基因。同时,利用western blot检测了KRAS相关的信号通路,发现miR-30b可能通过RAS/RAF/MEK/ERK信号通路发挥抑癌作用。最后,结合本课题组前期的研究成果,我们对microRNAs的相互作用进行了初步探索。前人的研究结果表明miR-217在胰腺癌中也可靶向KRAS发挥抑癌基因的作用,因此我们对细胞进行miR-30b mimics和miR-217mimics共转染,双荧光素酶报告基因实验的结果显示共转染对KRAS基因的抑制程度高于miR-30b或miR-217的单独作用,提示两者可能具有协同作用。并且CCK-8检测细胞活性的结果也支持了这一结论。综上所述,hsa-miR-30b在胰腺癌中表达下调,恢复hsa-miR-30b的表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,并抑制细胞的迁移侵袭,这些作用可能是通过hsa-miR-30b对KRAS的直接靶向作用而产生,并且hsa-miR-30b和hsa-miR-217可共同靶向于KRAS,发挥抑制肿瘤的协同作用。