红树植物秋茄氧化酶的性质研究

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红树林是生长在河口潮间带的木本植物群落,由于红树林湿地系统处于热带、亚热带淡水和海水的交互地带,可以对存留在泥滩中的重金属等污染物通过物理、化学及生物作用起到净化效果,所以红树林湿地系统对污染物的监测和净化不容忽视。随着河口海岸较为严重的重金属等污染物的污染问题,运用酶学手段探索多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO,EC.1.14.18.i)本文又称酪氨酸酶、过氧化物酶(peroxi-dase,POD,EC1.11.1.7)的酶学性质与污染物影响的相关性,试图建立快速,准确的污染物监测方法。以红树植物为研究对象,对其中的过氧化物酶和多酚氧化酶进行分离纯化,并研究其性质,为筛选在重金属等污染物的污染及净化中有良好效果的红树植物提供依据。   以福建省漳州市云霄县采集的红树植物秋茄为材料,通过缓冲液提取,硫酸铵分级分离,Sephacryl S-200分子筛柱层析和DEAE-sephacel阴离子交换柱层析,从红树植物的项芽中分离纯化出了秋茄过氧化物酶和秋茄多酚氧化酶。SDS-PAGE结果显示秋茄过氧化物酶和秋茄多酚氧化酶均得到了纯化,分子量分别为38KDa和43KDa。研究表明,秋茄过氧化物酶和秋茄多酚氧化酶的最适pH分别为pH6.2和pH6.8,最适温度分别为60℃和40℃。过氧化物酶在pH8.0-13.0,温度在20-45℃环境下活性较稳定,多酚氧化酶在pH5.5-8.5,温度小于40-60℃环境下活性相对稳定。过氧化物酶催化愈创木酚的Km和Vmax分别为11.49mmol/L和63.20μmol/(L·min),最适过氧化氢浓度是0.2%,而多酚氧化酶催化L-DOPA的Km和Vmax则分别为0.37mmol/L和0.09μmol/(L·min)。   研究金属离子、有机溶剂、合成有机酸对两种酶的影响表明:Li+、Na+、K+对过氧化物酶活力几乎没有影响,Mg2+、Fe3+和Al3+有轻微激活作用,而Ca2+、Ba2+、Cd2+、Co2+和Zn2+有轻微抑制作用,Cu2+、Pb2+、Fe2+、Mn2+有较强的抑制作用,有机溶剂对过氧化物酶有较强的抑制作用,其抑制作用强弱顺序为异丙醇>乙醇>甲醇;Li+、Na+、K+、Mn2+、Pb2+和Co2+对多酚氧化酶活性没有影响,Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+和Fe3+对多酚氧化酶均有不同程度的激活作用,Cd2+、Al3+和Cu2+对该酶有不同程度的抑制作用,Al3+和Cu2+对多酚氧化酶的抑制类型分别表现为非竞争性抑制和竞争性抑制,抑制常数K1分别为0.79mmol/L和0.29mmol/L,合成有机酸4-羟基苯丙烯酸对多酚氧化酶活力的抑制机理为不可逆抑制,3,4,5-三羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、4-乙基苯甲酸对多酚氧化酶活力的抑制类型表现为竞争性抑制,抑制常数K1分别为0.09mmol/L、0.12mmol/L和0.51mmol/L。   研究红树植物乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用表明:四种红树植物秋茄(Kandelia candel)、桐花树(Aegiceras corniculatum)、白骨壤(Avicenniamarina)和红海榄(Rhizophora slylosa)的乙醇提取物,其抑制作用强弱顺序为秋茄>桐花树>白骨壤,红海榄对蘑菇酪氨酸酶活力没有影响;秋茄各部位乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用强弱顺序为叶>茎>果>根;桐花树各部位乙醇提取物对对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用强弱顺序为茎>叶>根>果;桐花树乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制类型表现为竞争性抑制,抑制常数K1分别为0.18mg/ml。
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