【摘 要】
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长春花（Catharanthus roseus）由于可合成长春碱、长春新碱等抗肿瘤药物而受到广泛关注。其中,长春质碱（Catharanthine）作为合成长春碱的前体物质,不仅能够降低血糖与血压,还具有一定的抗菌作用。然而,单萜吲哚生物碱在长春花内含量较低,难以提取,且由于其结构复杂,难以采用化学方法合成。遗传转化作为一种成熟的技术,在植物中被广泛应用,但由于遗传转化耗时较长,导致基因功能研究效率
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长春花（Catharanthus roseus）由于可合成长春碱、长春新碱等抗肿瘤药物而受到广泛关注。其中,长春质碱（Catharanthine）作为合成长春碱的前体物质,不仅能够降低血糖与血压,还具有一定的抗菌作用。然而,单萜吲哚生物碱在长春花内含量较低,难以提取,且由于其结构复杂,难以采用化学方法合成。遗传转化作为一种成熟的技术,在植物中被广泛应用,但由于遗传转化耗时较长,导致基因功能研究效率低下,因此应用受限。而瞬时转化技术因具有方法简单、用时短、表达效率高等特点,在基因功能的研究中被广泛应用。本实验通过农杆菌介导的瞬时转化技术,一方面直接对长春花根、茎、叶进行侵染;另一方面先用纤维素酶、木聚糖酶对长春花根、茎、叶进行预处理,然后侵染,进而分析农杆菌介导的瞬时转化在长春花根、茎、叶中的转化效率,最终建立长春花根、茎、叶组织的瞬时转化体系。主要研究成果如下:1)常规侵染方法对长春花根、茎、叶的侵染效果利用三种不同的常规侵染方法,侵染后暗培3 d,提取RNA,反转录为cDNA。以长春花根、茎、叶cDNA为模板进行PCR,并对产物进行凝胶电泳检测,结果发现经过侵染后的长春花叶片电泳样品中出现了GUS基因条带,表明GUS基因在长春花叶片中成功转化,而长春花根、茎电泳样品中无GUS基因条带,表明GUS基因未能转化。在对长春花叶片cDNA进行实时定量PCR检测后则发现,基因表达水平随着菌液OD增加呈现逐渐递增趋势。2)酶处理法对长春花根、茎的侵染效果为了提高长春花根、茎的侵染成功率,本实验选用了木聚糖酶与纤维素酶两种酶对长春花根、茎、叶进行预处理,扫描电镜发现,长春花根、茎组织的细胞壁被部分降解,且不影响细胞活力。然后对预处理过的根、茎组织进行侵染,暗培3 d。经过RNA提取、反转录以及PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测,结果发现,纤维素酶酶解后的长春花根、茎电泳样品中检测到GUS基因条带,表明GUS基因在经过纤维素酶酶处理的长春花根、茎中成功转化;而经过木聚糖酶及混合酶（两种酶溶液1:1混合）酶解后的长春花根、茎凝胶电泳结果中无GUS基因条带出现,表明GUS基因未能成功转化。3)不同浓度纤维素酶对长春花根、茎的侵染效果由于木聚糖酶和混合酶对长春花根、茎的侵染无明显促进作用,本实验仅以纤维素酶浓度为变量对预处理后长春花根、茎进行了进一步研究。不同浓度纤维素酶处理侵染的长春花根、茎暗培3 d,经RNA提取与反转录,PCR产物凝胶电泳验证后,进行实时定量PCR进行进一步验证。结果发现,浓度为840 U/m L的纤维素酶溶液酶解后的长春花茎电泳样品中出现了GUS基因条带,表明GUS基因成功转化,在根中则未发现明显GUS基因条带;而1080U/m L浓度纤维素酶溶液酶解后的长春花根、茎样品中均出现了GUS基因条带,表明GUS基因均成功转化。4)侵染后表达时间对酶解后长春花根、茎表达水平的影响本实验对不同侵染后表达时间对基因表达水平的影响进行了进一步实验,即采用纤维素酶预处理,然后侵染长春花根、茎,分别暗培24h、36h、48h后取样测定。结果发现,所有样品中均出现了GUS基因条带,表明GUS基因成功转化。同时,实时定量PCR结果显示,长春花茎中的GUS基因表达量在24h时达到最高水平,而根中的GUS基因表达量则在36 h时达到最高水平,表明使用纤维素酶预处理长春花茎部时,侵染后最佳取样时间为侵染后24 h,而使用纤维素酶预处理长春花根部时,最佳取样时间为侵染后36 h。综上所述,本实验首先证明了常规的侵染方法可以成功侵染长春花叶片,但对长春花根、茎无明显作用。为了提高长春花根、茎的侵染成功率,本实验成功鉴定了纤维素酶对长春花根、茎细胞瞬时转化的促进作用,同时,对酶种类的选用、酶处理时间、酶处理浓度及侵染后表达时间进行了初步优化。本研究最终成功建立了长春花根、茎、叶组织的瞬时转化体系,为今后研究代谢途径相关基因的功能以及长春花中次生代谢产物合成的调控提供了新的策略。
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