论文部分内容阅读
微生物在自然界碳、氮等多种元素循环中扮演着重要的角色，是有机化合物包括芳烃污染物的主要分解者。多个种属的细菌和真菌在分解代谢多种芳烃化合物时通过不同的途径进入三羧酸循环并且这已经在分子和生化水平上有了较为透彻的研究。但是能够降解芳烃物质的古菌却鲜有报道。嗜盐古菌Haloferax sp.D1227能够以多种芳香酸为唯一碳源和能源生长，但其代谢途径中生化和分子水平方面却没有深入研究。 本研究发现，在嗜盐古菌D1227利用苯甲酸、3-羟基苯甲酸以及苯丙酸为唯一碳源和氮源生长时，其中龙胆酸（2，5-二羟基苯甲酸）1，2-双加氧酶(Gentisate1，2-dioxygenase，GDO)活力不受3-羟基苯甲酸诱导，而龙胆酸途径中的顺丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶(Maleylpyruvate hydrolase，MPH)活力受其诱导。在D1227基因组序列中发现了两个编码GDO的基因（hagA1和hagA2）以及附近的可能编码MPH的基因（hagF1和hagF2）。首先将这四个基因在大肠杆菌Rosetta中表达，只有hagF2能够过量表达但是没有检测到MPH活力或是顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶(Maleylpyruvate isomerase，MPI)活力;将目的基因与另一表达载体pTA1288连接后转入嗜盐古菌Haloferax vocalnii H1424中，纯化HagA1和HagA2并检测到明显的GDO活力，其中HagA1活性依赖于亚铁离子而HagA2不依赖;也检测到HagF2的MPH活力，但是没有检测到HagF1的MPH或是MPI活力。当选择古菌常用表达宿主Haloferax vocalnii WFD11时，结合酶活检测和SDS-PAGE结果，推测常用的表达宿主嗜盐古菌WFD11可能是一株未被发现的芳香酸类物质的降解菌，底物生长实验和酶活检测结果证实该菌能够利用3-羟基苯甲酸和3-羟基苯丙酸为唯一碳源和氮源生长并且粗酶液表现出GDO活力;此外，本研究还选用台北、台南、海门和如东四个地方的土样进行筛菌，结果表明每个样本中都含有能利用多种高浓度芳香酸类物质的原核生物。 本研究建立和完善了古菌中芳烃代谢的研究技术平台。证实嗜盐古菌D1227中两个GDO的编码基因并完成了相关性质研究，比较了嗜盐古菌中GDO与真核生物和细菌中的异同。发现了嗜盐古菌D1227龙胆酸代谢途径中编码MPH的代谢基因，为古菌中龙胆酸代谢途径中直接水解途径的揭示和深入研究打下基础。另外还发现另一株能够以芳香酸类物质为唯一碳源和能源生长的嗜盐古菌WFD11。