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木霉菌对多种植物真菌病害具有优良的生物防治效果,为了研究木霉的生物防治机理,木研究首先构建了哈茨木霉ACCC30371菌株的转录组,获得高质量的Unigene基因,之后对转录组获得的与生物防治相关的基因进行生物防治功能分类;进一步筛选到两条生物防治功能基因刺激植物响应蛋白基因epl1和蛋白酶基因ss,并对之进行了功能研究。研究结果如下:以1/2PD、MM(含葡萄糖10g/L)、N饥饿、C饥饿、以及1%植物病原真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)细胞壁研磨粉分别诱导培养哈茨木霉ACCC30371,构建转录组,获得4Gbp数据,其中96.68%的数据测序错误率不高于1%,以此标准进行数据统计,共得到25013条Unigene,平均长度为1135nt,长度大于3000nt的为2571条;其功能注释到Nr蛋白库的16360条,SwissProt蛋白库9875条,KEGG蛋白库10026条,注释到COG蛋白库的7164条,GO蛋白库的1508条;构建获得共计16723条功能基因。通过对哈茨木霉转录组Unigene基因分析,共获得与真菌病害生防相关的基因四大类,包括竞争作用机制类基因14条,重寄生机制相关基因311条,抗生机制相关基因76条,刺激植物响应蛋白基因1条,共计402条基因。经分析认为哈茨木霉的生物防治机制是以重寄生为主的综合防治机制,抗生作用和诱导系统抗性也在其中占有重要地位。这对于进一步研究木霉生防机制、开发利用生防功能基因和研制生物杀菌剂具重要意义。克隆获得了刺激植物响应蛋白基因epl1全长cDNA序列、启动子序列。cDNA序列已提交至GenBank,序列号为KC876056。分析发现该蛋白属于Cerato-platanin家族(Pfam07249),将Epl1蛋白对深绿木霉、绿色木霉、棘孢木霉、哈茨木霉基因组进行相似性搜索,共发现相似序列15条,蛋白保守区长度在113-120之间,哈茨木霉CBS 226.95染色体骨架6上的Epl1-Tha与Epl1蛋白相似性为100%。用RT-qPCR技术研究了在8种营养条件下epl1基因转录水平上的表达:MM培养基中epl1基因表达量随时间呈周期性的增加;接触植物成分(山新杨根、茎、叶研磨粉)后表达量持续升高,最高达处理前的32倍以上;C饥饿时表达量短时间内迅速升高,后期维持稳定状态;N饥饿时上调表达量较小;杨叶枯病菌细胞壁及发酵液存在时,表达量上升,但变化程度低于MM同一时间点;总体上8种诱导方式均能使epl1上调表达。成功构建了epl1的重组载体pGEX-epl1及重组菌株BL21-epl1,SDS-PAGE蛋白电泳发现符合预期分子量40.5kDa的蛋白质大量表达,为蛋白的生产、分离与功能研究奠定了基础。克隆获得了枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因ss全长cDNA序列,cDNA序列已提交至GenBank,序列号为 KC876057。其蛋白属于 Peptidases_S8_PCSK9_ProteinaseK_like(Pfam00082)家族。将SS蛋白对上述4个近源种基因组搜索,获得21条相似序列,哈茨木霉CBS 226.95染色体骨架6上的SS1-Tha与目标蛋白相似性为100%。对四个基因组上丝氨酸蛋白酶编码基因启动子区调控元件结合基序进行分析,发现丝氨酸蛋白酶与木霉生防作用密切相关。用RT-qPCR技术研究上述8种营养条件下ss基因转录水平上的表达,发现在MM、C饥饿和植物根成分存在时各时间点表达量是对照的0.7-3.8倍之间,总体上8种诱导处理方式对哈茨木霉ACCC30371菌株ss基因的表达量影响不大。成功构建了蛋白酶基因ss的重组载体pGEX-ss及重组菌株BL21-ss,SDS-PAGE蛋白电泳发现符合预期分子量68.7kDa的蛋白质大量表达,本研究为哈茨木霉生物农药的研制提供理论支持,对蛋白酶类生物农药的研制具有一定的参考价值。