京尼平的微生物制备及其作为交联剂的应用研究

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栀子是茜草科(Rubiaceae)栀子属(Gardenia)植物,是一味常用中药,具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等作用。据栀子中主要药理药效成分的研究报道:栀子中起主要药效作用的主要成分是栀子苷元—京尼平。但是京尼平在栀子中的含量很低,约为0.005%~0.01%,主要是以其前体形式——京尼平苷形式存在,含量约为3%~5%。因此如何提高京尼平的含量成为当今乃至今后研究的重点。在文献报道中提高栀子中京尼平含量的方法主要有酶解法,但其存在一些缺陷,如酶以及京尼平苷价格昂贵等,未能应用于实际生产。本论文通过微生物发酵法实现对京尼平苷的转化,无需将酶及京尼平苷提纯,因此有效的避免了上述方法存在的缺陷。京尼平的不仅具有重要的药效作用,还可以作为一种新型的生物材料交联剂。它不仅能形成稳定的交联制品,还具有细胞毒性小,生物相容性好,抗降解能力强和应用领域广泛等优点,是非常有前途的交联剂。本研究的主要研究内容以及结果如下:Ⅰ、转化京尼平苷的菌种筛选:筛选、分离具有转化京尼平苷为京尼平的高转化菌株,并对菌种进行鉴定。以栀子果粉为碳源建立的筛选模型,分离到具有转化京尼平苷为京尼平的β-葡萄糖苷酶高产菌株。经过对发酵产物TLC和HPLC分析,得到一株优良菌株GP-4,此菌株具转化专一性、高效性。Ⅱ、微生物发酵栀子条件的优化:优化发酵工艺,得到最佳转化参数,提高生产菌种的转化水平,获得更多的目的产物。以转化后京尼平含量为指标,分别从对发酵温度、底物浓度、装液量、转速、转化时间等几方面进行单因素实验,从而确定京尼平苷转化的最佳条件,使京尼平苷最大程度的转化为京尼平。实验结果是:将使用玉米糖化液培养得到的菌种,洗涤后接入到京尼平苷浓度为1.5%、(NH42SO4 0.1%、MgSO4 0.1%、KH2PO4 0.2%、pH自然的转化培养基中,转速150rpm、装液量40%、温度28℃、转化时间30小时。经此条件京尼平苷转化率最高,可达到98%以上。Ⅲ、微生物发酵栀子的动力学研究:通过对发酵过程中碳源、氮源、菌体量、β-葡萄糖苷酶酶活、京尼平苷以及京尼平含量的变化,探讨发酵过程中影响京尼平苷转化为京尼平的主要因素及其动力学的基本特征。进而为发酵过程的参数控制和发酵规模的扩大提供重要的理论依据和数据。Ⅳ、京尼平的分离提取及其结构鉴定:建立分离纯化京尼平的工艺路线,并对分离产物进行结构鉴定。筛选出D141和HPD300的混合树脂用于京尼平的吸附,并通过一系列的系统行为调控试验,最终得到了京尼平的最佳提取工艺:京尼平浓度为2mg/ml,加入NaCl 5%,并调pH为4,以4.8BV/h的速度通过D141∶HPD100=8∶5的混合大孔吸附树脂,到达泄漏点时停止上样,然后用丙酮∶乙醇=1∶1的洗脱剂洗脱至无京尼平检出为止。通过大孔吸附树脂结合硅胶柱层析分离法分离出京尼平结晶纯度为95%以上。经HPLC、UV、IR、HNMR鉴定分离白色针状结晶为京尼平。Ⅴ、京尼平作为交联剂的应用研究:通过测定不同交联条件制备的材料的交联度,确定其最佳的交联条件为:磷酸缓冲液(pH 7.4)配制的京尼平浓度为0.5%的溶液,与胶原蛋白在室温环境下交联24h即可。通过测定交联产品的体外降解性、细胞毒性,证明京尼平作为交联剂比传统的化学交联剂有着较好的交联性能以及较低的细胞毒性。
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