前列腺癌(prostate caricer，PCa)是欧美男性发病率最高的恶性肿瘤，死亡率居第二位。近年来，随着生活水平的提高和人口老龄化比例的上升，我国PCa的发病率呈逐年上升趋势。尽管PCa患者行内分泌治疗能暂时缓解疾病，但大多数病例最终不可避免地进展为激素非依赖型前列腺癌(hormone-refractoryprostate cancer，HRPC)。目前HRPC缺乏有效的治疗，必须寻找新的治疗方法。近年来，为探索HRPC的有效治疗手段，免疫治疗在国内外备受关注。设计一种免疫治疗策略，降低免疫耐受和肿瘤免疫逃避，并产生持久有效的免疫应答，已成为PCa免疫治疗的方向。特别是以树突状细胞(dendritic cells，DCs)为基础的基因免疫治疗已显示出有效的临床治疗前景。 DCs能处理和呈递抗原肽给初始T细胞，从而诱发CD4<+>辅助性T细胞(helperT cell，Th)和CD8<+>细胞毒T细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的细胞免疫。用编码主要组织相容性抗原(major histocompatibility cmplex，MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子的全抗原负载DCs不必预先了解患者人类白细胞抗原(human leukocyteantigen，HLA)表型，而且这种多克隆疫苗能够诱发针对多表位的T细胞免疫应答，减少肿瘤免疫逃避的发生。此外，激活HLA Ⅱ类分子限制性的Th细胞免疫能进一步放大和加强T细胞应答。肿瘤总RNA作为全抗原还具有更多的优势也显得更安全：能迅速降解、不同基因组整合、不会诱发自身抗体。对于肿瘤的免疫治疗，HLA限制性的CTL提供最有效的方式。 第一部分肿瘤RNA转染DCs与CIKs共培养在体外抗HRPC的生物学效应。 目的：评价同种肿瘤RNA转染DCs与CIKs共培养体外抗肿瘤的细胞毒活性。 材料与方法：DCs和CIKs分别利用健康人的外周血单个核细胞(PBMC)在不同的细胞因子作用下诱导培养。粘附细胞在含10﹪人AB型血清的RPMI1640，并补充IL-4，GM-CSF和TNF-α等诱导培养。非粘附细胞在包被anti-CD3单克隆抗体的培养瓶内，用含IL-2和10﹪人AB型血清的RPMI1640诱导培养。利用两种HRPC细胞株PC3和DU145来源的总RNA脂质体转染法转染不成熟的DCs，待其成熟后与同源CIKs共培养。利用流式细胞仪检测DCs和CIKs的表型以及共培养细胞中CD4<+>CD25<+>免疫调节T(regulatory T lymphocyte，T<,reg>)细胞的变化。胞内细胞因子染色检测胞内INF-γ和IL-4的产生。以HeLa细胞作为对照靶细胞，乳酸脱氢酶释放实验检测共培养细胞体外杀伤PC3和DU145的细胞毒活性。 结果：培养的DCs显示成熟的树突状形态和典型的表型表达。肿瘤RNA能有效地负载DCs，流式检测其转染效率为28.6±3.2﹪。流式证实RNA转染的DCs与CIKs共培养促进了CD3<+>CD4<+>，CD3<+>CD8<+>细胞的比例，而CD3<+>CD56<+>NKT和CD3-CD56<+>NK细胞相对降低。体外杀伤实验显示共培养的DC-CIKs显著提高了对HRPC细胞的杀伤活性。在效靶比,20：1时，从26﹪(CIKs引起的细胞毒性)提高到80.8﹪。胞内因子染色证实RNA转染的共培养细胞促进了胞内IFN-γ的产生，提高了CD4<+>Th1(IFN-γ<+>IL-4<->)细胞(从CIKs中的25.17﹪提高到55.52﹪)和CD8<+>T(IFN-γ<+>)细胞(从CIKs中的31.78﹪提高到69.59﹪)的比例，而CD4<+>CD25<+>Treg细胞从CIKs中的20.76﹪降低到9.72﹪。 结论：我们的研究表明，肿瘤RNA转染的DCs与同源CIKs共培养在体外明显增强了抗HRPC的细胞毒活性，这可能与共培养的细胞中增加的CD4<+>(IFN-γIL-4<->)Th1和CD8<+>Tc1(IFN-γIL-4<->)细胞和减少的CD4<+>CD25<+>Treg细胞有关。 第二部分肿瘤RNA转染DCs与CIKs共培养在体内抗HRPC的生物学效应。 目的：为了检验肿瘤RNA转染的DCs与CIKs共培养的细胞回输体内能否抑制肿瘤生长，我们用荷瘤SCID小鼠来观察共培养细胞在体内抗肿瘤免疫效应。 方法：用24只6-8周龄的近亲繁殖的雄性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的右侧腹股沟皮下接种PC3细胞产生前列腺癌动物模型。当皮下肿瘤直径达到4.5-5.5mm时，将24只SCID小鼠按照随机数字表随机分成4组，每组6只。在RNA转染DCs与CIKs共培养后的第7天，4个实验组分别回输生理盐水(NS)，CIKs，DC-CIKs(未转染的DCs与CLKs共培养)和RNA-DC-CIKs(RNA转染的DCs与CIKs共培养)，依次命名为：NS组，CIKs组，DC-CIKs组和RNA-DC-CIKs组。效应细胞用量为每次回输500μl培养上清含有10<7>效应细胞，NS组每次注射500μl NS，每3天一次，共5次。每4天测量肿瘤最长径和最短径。当对照组(NS)肿瘤直径大于12 mm时(也就是第一次回输效应细胞后6周)，小鼠被处死，记录肿瘤大小和重量。无菌取出肿瘤标本，取一部分作固定、石蜡包埋，组织学切片作HE染色和TUNEL凋亡分析。 结果：成功地制备了SCID小鼠皮下移植瘤模型。在治疗前，各组间肿瘤大小经Kruskal-wallis检验无显著性差异(P=0.461)。治疗后6周，组间肿瘤大小和肿瘤重量均存在显著性差异(P=0.000)。进一步利用Kruskal-Wallis检验进行组间两两比较(p值校正为p<0.05/6即0.0083，显著性差异水平)，结果显示肿瘤大小和重量在CIKs和DC-CIKs无显著性差异(p值分别为0.025和0.809)。其他组间两两比较均有显著性差异(p均小于0.008)。组织学病理检查和TUNEL凋亡分析显示在各免疫治疗组均可见肿瘤细胞凋亡和坏死。进一步发现在CIK和DC-CIKs治疗组移植瘤内癌巢大部分破坏，而RNA-DC-CIKs免疫治疗组癌巢完全破坏，肿瘤细胞片状坏死，肿瘤细胞凋亡明显(核浓染，核固缩，核断裂，凋亡小体形成)。TUNEL试验分析细胞凋亡在RNA-DC-CIKs组比CIKs更明显。 结论：肿瘤RNA负载DCs与同源CIKs共培养回输体内显著抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡和坏死，这为临床HRPC提供一种有效地免疫治疗策方法。 第三部分肿瘤RNA转染DCs与同源CIKs共培养调控Akt/NF-к B细胞生存信号通道的实验研究。 目的：研究肿瘤RNA转染。DCs与同源CIKs共培养对HRPC细胞株PC3细胞内Akt/NF-к B生存信号通道的影响，探讨这种免疫治疗引起肿瘤细胞凋亡的分子机制。 方法：按照第一部分的方法准备CIKs、DC-CIKs和RNA转染的共培养的DC-CIKs，作为效应细胞，以传代培养的PC3细胞作为靶细胞，按照效靶比20：1，分别加到TRANSWEIL 6孔细胞培养板(上室底面膜上孔径为0．4 μ m)的上、下室，每孔加靶细胞5×10<5>，作用4-6小时后，取出内室，去除效应细胞，消化、洗涤、离心收集各孔靶细胞。分别提取细胞可溶性总蛋白和核蛋白，分装冻存备用。利用SDS-PAGE分别分离总蛋白和核蛋白。利用兔抗人的多克隆抗体Akt，phospho-Akt和phospho-IKK<,α/β>检测各实验组总蛋白中相应的目的蛋白表达量，利用兔抗人的多克隆抗体NF-к Bp65检测各实验组核蛋白中NF-к Bp65的表达量，以未干预的PC3细胞总蛋白和核蛋白作为阴性对照，以P13K抑制剂LY294002作为实验的阳性对照，Western Blotting检测上述蛋白的表达。以β-actin作为内参照，利用Quantity One软件定量分析。 结果：以未干预的PC3细胞作为阴性对照，CIKs、DC-CIKs和RNA-DC-CIKs各免疫效应细胞处理组均显著抑制了细胞浆中磷酸化Akt和磷酸化IKK<,α/β>的表达。转录因子NF-к Bp65的核定位减少，表达量降低。但胞浆中总Akt表达在实验组和对照组之间无显著性差异。各实验组间表达量比较，结果显示在RNA-DC-CIKs组phospho-Akt和phospho-IKK<,α/β>和转录因子NF-к Bp65表达量比CIK组更低，但无显著性差异。 结论：肿瘤RNA负载DC-CIKs、DC-CIKs和CIKs均能显著抑制PC3细胞内Akt的活化，降低活化的IKK<,α/β>的表达，导致转录因子NF-к Bp65核内定位和表达降低，从而抑制细胞生存信号通道，诱导肿瘤细胞凋亡。