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研究目的肺癌是最常见的肺部原发性恶性肿瘤,又称原发性支气管肺癌,治疗手段包括手术、化疗、放疗、介入治疗及近几年发展起来的免疫治疗和新型靶向治疗药物,但其发病率和死亡率仍居我国癌症首位。特定频率、强度的磁场具有抑制肿瘤生长的作用,并已在临床上得到应用,但磁场抗肿瘤的机制仍不明确。本实验旨在研究一种静磁场调制的50 Hz极低频电磁场对肺癌细胞的抑制作用并探索其机制。前期的研究发现一种平均强度5.1 mT的静磁场调制的50 Hz极低频电磁场对多种肿瘤的生长具有抑制作用,本课题沿用了此方案来验证该磁场对肺癌细胞的作用,并主要针对自由基水平、DNA损伤和修复通路,对该磁场抑制肺癌的细胞内机制进行了探索。材料和方法本实验采用的细胞系包括人肺腺癌细胞A549,鼠肺腺癌细胞LLC,永生化人肺支气管上皮细胞Beas-2B,人肺非小细胞肺癌细胞H460、H1975、H1650,野生型小鼠胚胎成纤维细胞MEF,NBS1敲除小鼠胚胎成纤维细胞NBS1-/-MEF,以及MDC1敲除小鼠胚胎成纤维细胞MDC1-/-MEF。电磁场发生设备为实验室自行开发。细胞在磁场中暴露条件为:在培养箱中培养的细胞每日暴露于静磁场调制的50Hz极低频电磁场,叠加磁场平均强度为5.1 mT,,每天2h,连续3天;或持续暴露0.5h及以上。1.磁场对肺癌细胞的抑制作用:通过活细胞计数与CCK8法分析磁场暴露下A549、LLC、Beas-2B、H460、H1975、H1650细胞生长曲线和磁场对细胞的抑制率;在A549细胞中,将磁场暴露与化疗药物顺铂、紫杉醇联用;BrdU方法检测细胞增殖率;流式细胞法检测细胞凋亡;2.磁场暴露对细胞内自由基浓度的影响:在A549细胞中,通过DCFH-DA探针检测磁场暴露前后细胞内ROS水平;并使用自由基清除剂NAC分析磁场对A549细胞生长的影响是否依赖于自由基;3.磁场暴露诱导DNA损伤情况及与自由基的关系:A549细胞中,通过DNA碱性、中性彗星实验观察DNA单双链断裂,并联合NAC观察磁场诱导DNA损伤是否依赖于自由基;通过q-PCR分析磁场暴露前后DNA损伤修复相关基因表达变化;通过损伤修复缺陷的工具细胞NBS1-/-MEF、MDC1-/-MEF验证磁场对细胞生长的抑制与DNA损伤有关;4.磁场暴露下细胞内微管变化:tubulin免疫荧光实验观察微管形态的改变;5.磁场暴露后细胞自噬变化:通过Western blotting及细胞免疫荧光实验分析磁场暴露前后细胞自噬标记物表达;Lysotrackerprobes观察溶酶体变化。结果肺癌细胞A549、LLC、H460暴露于磁场2天(2h/天)后,细胞生长明显受到抑制;暴露3天后,抑制率达到20-30%。而正常人肺支气管上皮细胞Beas-2B、肺癌细胞H1650和H1975暴露于同样磁场条件后,未出现明显抑制。同时,磁场可进一步增强化疗药物顺铂、紫杉醇对肿瘤细胞的作用。进一步发现,该磁场对肺癌细胞生长的抑制作用是通过抑制细胞增殖而非诱导凋亡。磁场暴露后A549细胞中自由基含量明显升高,自由基清除剂NAC可对暴露于磁场中的A549细胞产生一定保护,降低磁场对细胞的抑制作用。磁场暴露可诱导DNA损伤,发生DNA单双链断裂;且DNA损伤修复缺陷的细胞对电磁场更敏感;使用自由基清除剂NAC可以显著降低DNA损伤程度,说明磁场诱导DNA损伤是通过自由基增加而引起。Tubulin免疫荧光显示磁场暴露后细胞内微管丝网状结构消失,细胞间连接明显减少,提示电磁场可能通过影响微管正常形态,并可能进一步影响纺锤体功能,阻滞细胞周期。A549、LLC细胞暴露于磁场,2天后自噬标记蛋白LC3Ⅱ表达水平明显增加,并在胞浆内呈点状聚集,提示该磁场诱导自噬水平上升。综上,本课题中所用的平均强度5.1mT的静磁场调制的50Hz极低频电磁场可选择性抑制肺癌细胞,主要影响分裂增殖,与化疗药物具有协同作用;其机制是通过诱导自由基的增加从而引起DNA损伤;同时,微管形态异常和自噬水平改变亦可能参与磁场对肺癌细胞的抑制。结论1.平均强度5.1 mT的静磁场调制的50 Hz极低频电磁场对肺癌细胞具有特异性抑制作用,主要表现为细胞增殖率下降;磁场可与传统化疗药物协同抑制肺癌细胞;2.该磁场可诱导自由基水平升高,引起DNA单双链断裂,进而抑制肺癌细胞生长;3.该磁场可引起微管形态异常并诱导自噬水平提高,可能与其对肺癌细胞的的抑制作用有关。