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植物在长期的进化过程中发展了一套十分复杂精密的基因表达调控体系来抵御外界的逆境胁迫。这种基因表达调控主要是转录因子在转录水平上的调控,转录因子可以通过与相应的顺式作用元件结合,同时调控与同类抗逆性状相关的多个基因的表达,使植物作出适应逆境胁迫的代谢调整。WRKY类转录因子是植物中特有的一类转录因子,研究表明,它参与了多种逆境胁迫反应。本研究利用生物信息学手段克隆了葡萄的VtWRKY11、VtWRKY2、VtWRKY1基因,并对VtWRKY11和VtWRKY2进行了酵母单杂交、细胞定位、荧光定量PCR等分析,对VtWRKY11基因还进行了拟南芥的遗传转化和相关的功能分析。主要结果如下:
1.在北丰和董氏葡萄中分别克隆了VtWRKY11、VtWRKY2、VtWRKY1基因,全长分别为1255bp、1661bp和1812bp,编码339个氨基酸、530个氨基酸和603个氨基酸。不同植物的WRKY蛋白序列比对分析表明,它们所含有的WRKY结构域在进化上很保守。系统进化树分析表明,VtWRKY11蛋白属于WRKY基因家族的第Ⅱd类;VtWRKY2和VtWRKY1蛋白属于WRKY基因家族的第1类。
2.酵母单杂交实验分析表明VtWRKY11、VtWRKY2具有与葡萄Vst1基因中的W盒中核心碱基序列GTCA特异结合的特性,同时核心碱基序列GTCA发生突变后,VtWRKY11、VtWRKY2失去这种结合特性。
3.亚细胞定位表明VtWRKY11、VtWRKY2都定位于细胞核,与软件预测的结果相符,说明是核定位蛋白,具有转录因子的基本特征。
4.荧光定量PCR分析VtWRKY11、VtWRKY2的表达模式的结果表明,VtWRKY11基因的转录本在病原菌处理后4h达到一个高峰,其表达水平是对照的30倍左右;在SA处理后2h达到一个最高点,其表达水平是对照的100倍左右。VtWRKY2基因的转录本在病原菌处理后的24h达到最高水平,升高到原来的9倍;在SA的处理下则迅速升高,2-24h内一直维持一个较高的水平。
5.构建了VtWRKY11的植物过量表达载体,用农杆菌介导转化拟南芥,T2代植株对病原菌的敏感性与野生型相比没有差异,但对mannitol的抗性比野生型增强,并且VtWRKY11在拟南芥中的过量表达提高了AtRD29A,AtRD29B基因在转基因幼苗中的表达水平。