牛支原体（Mycoplasma bovis）可以引起犊牛肺炎、关节炎,成年母牛乳腺炎等疾病,给养牛业造成了巨大的经济损失。研究表明,牛支原体主要通过膜蛋白的黏附作用进而定殖于宿主细胞,并通过代谢产物造成宿主细胞损伤和死亡。目前已知的24Ku、pMB67、P26等脂蛋白的生物学功能已经得到证实,但是仍有许多脂蛋白未被发现。关于牛支原体P59蛋白及其功能的研究尚未见报道。本研究利用生物信息学方法对编码P59蛋白的MBOVPG45₀018基因序列进行分析,并将蛋白进行原核表达,对该蛋白的生物学功能进行研究。同时建立了牛支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,为牛支原体病致病机制的研究及病原防控提供试验数据。1.生物信息学方法分析牛支原体P59核酸序列、氨基酸序列并预测其功能:通过生物信息学方法分析P59核酸序列、氨基酸序列,结果表明P59蛋白可能是存在于牛支原体ABC转运系统的胞外组成蛋白,可能参与营养物质的摄取或转运过程,对牛支原体自身代谢具有重要的生物功能。2.牛支原体P59蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备:扩增P59基因,将其克隆到表达载体pET30a中,连接后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,成功诱导表达、纯化获得P59重组蛋白,并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。3.P59蛋白生物学功能的研究:（1）牛支原体膜蛋白、P59重组蛋白和胞浆蛋白的Western-blot结果表明,该蛋白可被P59兔多抗血清识别,说明该重组蛋白具有一定的反应原性。分别以牛支原体膜蛋白、胞浆蛋白为包被抗原,以P59兔多抗作为抗体进行ELISA试验。结果表明膜蛋白OD_450nm数值与胞浆蛋白OD_450nm数值差异显著（P<0.05）,综合Western-blot的实验结果,表明P59蛋白主要以膜蛋白形式存在于牛支原体中。（2）本实验采用制备好的P59兔多抗,观察多抗血清对牛支原体粘附于EBL细胞的影响。共聚焦显微镜下观察兔多抗血清组膜表面出现的绿色荧光少于兔阴性血清组膜表面出现的绿色荧光;表明P59兔多抗能封闭病原体,使黏附于EBL细胞上的支原体数量减少。（3）通过生长抑制试验对固体培养基中菌落计数,取3次试验平均值,P59兔多抗血清组平均生长抑制率为45.53%;表明P59兔多抗血清能对支原体的生长起到一定的抑制作用。（4）以P59蛋白作为刺激剂,刺激外周血淋巴细胞实验结果显示8头牛中1、3、4、5、6、7号牛OD_450nm与空白对照OD_450nm差异显著（P<0.05）,8号牛差异极显著（P<0.01）,表明P59蛋白作为刺激剂在一定程度下可以促进牛外周血淋巴细胞的增殖。4.牛支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立:选取MBOVPG45₀018基因序列,建立了牛支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。该方法灵敏度下限是常规PCR方法的100倍,不与多种相关病原菌发生交叉反应,具有较强的特异性,变异系数小于3%,奶样和鼻拭子样品阳性检出率均高于普通PCR,为牛支原体病原检测提供了更为特异、灵敏的检测方法。