通过筛选EMS诱变的拟南芥(Col-0)突变体库,获得一个对NH4+超敏的突变体hsn1(hypersensitive to NH4+1)。利用图位克隆的方法,克隆到该突变基因为AtGMP1,并依据所克隆的基因测定了突变体和野生型体内的GDP-甘露糖焦磷酸化酶酶活,维生素C含量和蛋白糖基化水平。研究了突变体以及野生型体内的UPR和细胞死亡情况,结果如下： 1.在含有NH4+的1/2 MS培养基条件下,突变体主根的生长相比野生型受到了严重阻碍,突变体主根构型受到严重破坏。生长于不含有NH4+的SN培养基上,突变体的症状被回复。由此表明突变体所表现出的生长缺陷与NH4+有关。植物体内NH4+浓度测定分析表明,生长在1/2 MS或SN培养基上,野生型和突变体体内的NH4+含量都无明显差异。但是当生长在1/2 MS培养基上时,野生型和突变体体内的NH4+含量明显高于生长在SN培养基上的。说明突变体生长在1/2 MS培养基上时生长受抑可能是由于突变体对NH4+含量的增加比较敏感。 2.通过与Landsberg erecta(Ler)的杂交F2群体的遗传分析,确定该突变属于单基因隐性突变。利用SSLP分子标记对1056株突变体的连锁分析,确定了第2条染色体的H13和H16之间约129kb范围。候选基因分析确定了GDP-甘露糖焦磷酸化酶AtGMP1的单碱基突变。等位突变体和转基因回复试验进一步证明了GDP-甘露糖焦磷酸化酶AtGMP1的单碱基突变是造成突变体表型的原因。通过对野生型和突变体体内的GMP酶活的测定,突变体体内的GMP酶活低于野生型,并且GMP酶活是和植物体内的NH4+浓度相关的,NH4+的浓度越高,GMP的酶活越低。野生型GMP蛋白和突变的hsn1蛋白在三种pH条件下酶活测定的试验结果也证明了这个观点。 3.野生型和突变体体内的维生素C含量检测和突变体vtc4-KO的生长试验的结果表明,突变体内维生素C含量的下降并不是造成突变体对NH4+超敏的主要原因。通过检测植物体内的蛋白质N糖基化水平,我们发现突变体地下部的蛋白质N糖基化水平下降,当培养基中NH4+存在时下降的更加严重。PDI的检测也暗示了培养基中NH4+存在时,野生型地下部的蛋白质N糖基化水平下降,虽然没有突变体下降的严重。因此,植物体内蛋白质N糖基化水平的下降是造成突变体表型的主要原因。 4.通过对突变体和野生型体内未折叠蛋白反应(UPR)和细胞死亡的分析,我们发现当生长在含有NH4+的培养基上时,突变体体内UPR激活,细胞死亡产生。野生型中虽然没有突变体那么严重,但是体内UPR也激活,细胞死亡也产生了。 上述研究结果表明,NH4+能抑制植物体内的蛋白质糖基化水平,激活植物体内的UPR和细胞死亡,当GDP-甘露糖焦磷酸化酶突变时,这种现象被加剧,影响植物正常的生长发育。这也为我们研究植物的NH4+毒害现象开辟了新的思路。