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单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种重要的人兽共患食源性致病菌，引起人和动物的败血症、孕妇流产、脑膜脑炎等。在LM感染过程中，多种毒力因子与宿主细胞相互作用，发挥其毒力，目前对于LM引发脑膜炎的作用机制并不清楚。鉴于此，本研究通过对LM的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ克隆、测序、构建诱饵质粒，并对诱饵质粒进行表达的检测和自激活的检测，为下一步酵母双杂交提供诱饵蛋白，从而进一步揭示这些诱饵蛋白在LM侵染大脑过程中的作用机制，以期为阐明LM的致病机理提供科学依据。主要研究内容和结果如下：1、LM毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ克隆及序列分析：为了研究单增李斯特菌新疆羊源临床分离的4b血清型菌株（简称LM90）毒力基因的变异情况。运用PCR技术对LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的最大开放阅读框进行扩增，亚克隆到pMD19-T载体中，筛选出阳性菌并进行序列的测定。将序列提交到GenBank上（登录号分别为KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612），测序后用DNAMAN软件对序列进行分析。结果：LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ与F2365参考株的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ核苷酸的同源性分别为98.04%、96.53%、98.20%、96.41%、98.23%，氨基酸的同源性分别为99.73%、99.83%、98.67%、99.66%、99.76%。可见单增李斯特菌新疆羊源临床分离株LM90毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ序列相对稳定。2、诱饵载体的构建及其功能的检测：为了利用酵母双杂交筛选与Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ毒力基因互作的宿主蛋白，构建5种毒力基因的诱饵载体是其基础。首先将经过sfiⅠ酶切的Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ毒力基因的克隆载体和诱饵载体PDHB1、PBT3-N进行连接，转化至E.coli DH5α，将重组诱饵质粒经PCR、酶切验证后，通过醋酸锂法转化至酵母NMY51中。其次对诱饵质粒在酵母中的表达情况进行检测：（1）用兔源的LM90的多克隆抗体和羊抗兔的HRP标记的二抗对酵母中的诱饵质粒进行Western blot检测。（2）将阳性载体pOst1-NubI和阴性载体pPR3-N分别转化至含有诱饵质粒酵母菌中，通过酵母菌在SD-Leu-His、SD-Leu-His-Trp和SD-Leu-His-Trp-Ade培养基中的颜色，判断诱饵质粒在酵母中的表达情况。结果：通过PCR和酶切鉴定，成功构建诱饵质粒并得到了阳性酵母菌。Western blot没有检测到诱饵蛋白，功能检测的阳性组在三种培养基中均有白色或者粉色的酵母菌落出现，而阴性组在SD-Leu-His-Trp、SD-Leu-His-Trp-Ade培养基中有极少量或没有酵母菌落长出，说明诱饵载体的蛋白已成功表达。3、抑制诱饵载体自激活3-AT浓度的筛选：为了抑制诱饵载体的自激活，降低酵母双杂交的假阳性，有必要进行His抑制剂3-AT浓度的筛选。将构建cDNA文库的空质粒pPR3-N通过醋酸锂法转化到表达诱饵质粒的酵母菌中，分别添加10M、15M、20M、25M、30M、35M、40M、45M浓度的3-AT，于SD-Leu-His-Trp-Ade培养基中，观察酵母菌的生长情况。结果：Ami-PDHB1、Auto-PDHB1、InlB-PDHB1、InlC-PBT3-N、InlJ-PDHB1酵母菌3-AT的最佳浓度分别为：45M、25M、30M、20M、20M。