拟穴青蟹凋亡抑制蛋白基因的全长cDNA克隆与干露胁迫下表达分析

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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海主要的海水养殖蟹类之一,具有重要的经济价值。随着人们生活水平的提高,拟穴青蟹无水保活运输变得越来越普遍,但该运输方式使拟穴青蟹处于一种无水干露状态,随着运输时间的延长常会导致一定比例的青蟹死亡,造成一定的经济损失。干露会引起失水,导致拟穴青蟹组织缺氧,使细胞处于低氧状态,从而引起细胞凋亡,严重时会引起细胞死亡。凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein,IAP)是抑制细胞凋亡的关键基因之一,目前有关IAP基因在蟹类中尚未见报道。本实验采用同源克隆策略和RACE技术在拟穴青蟹中成功克隆得到IAP基因的全长cDNA序列,分析了LAP基因核苷酸序列、氨基酸序列结构,采用实时荧光定量方法检测分析了IAP基因在拟穴青蟹不同组织中的表达情况,以及干露胁迫下拟穴青蟹肝胰腺中IAP基因的表达量。同时,采用RNA干扰技术对拟穴青蟹IAP基因进行干扰后,利用流式细胞仪检测了干露胁迫下拟穴青蟹肝胰腺细胞的凋亡情况。  拟穴青蟹IAP基因全长为3351 bp,包括1986 bp的ORF,编码662个氨基酸,5-UTR(5端非编码区)为270bp,3-UTR(3端非编码区)为1095 bp,GenBank的登录号为KT965726。生物信息学分析表明拟穴青蟹IAP蛋白具有3个BIR结构域和1个RING结构域。Blast分析比对显示,拟穴青蟹IAP基因与与南美白对虾(Penaeus monodon)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的IAP基因同源性最高,均为49%。NJ进化树表明拟穴青蟹首先与罗氏沼虾等甲壳动物聚在一起,且与家蚕等昆虫亲缘关系较近,聚为一支。  经实时荧光定量PCR检测,拟穴青蟹IAP基因在鳃、肝胰腺、肌肉、心、胃、眼柄和血细胞等7个组织中均有表达,且表达量不同。结果显示拟穴青蟹IAP基因在肝胰腺中表达量最高,其次为肌肉,在血细胞中表达量最低。拟穴青蟹IAP基因在鳃、胃、心和眼柄中表达量无显著差异(P>0.05)。干露6h后肝胰腺中 SpIAP基因的表达开始上升,12h显著升高(p<0.05),到24h达到最高(为初始值的7.5倍),后逐渐减低。  RNA干扰结果显示,注射siRNA组IAP基因的表达量显著低于对照组(P<0.05),而对照组(空白、注射PBS及注射random-siRNA)相互之间无显著差异(P>0.05)。结果表明注射的siRNA有显著的干扰效果。流式细胞仪检测RNA干扰后细胞凋亡的结果显示,IAP基因干扰后拟穴青蟹在干露胁迫24h后,其肝胰腺细胞凋亡率显著高于其它对照组(P<0.05)。  研究结果表明,IAP基因可抑制拟穴青蟹干露胁迫引起的细胞凋亡,为进一步深入研究IAP基因在甲壳动物细胞凋亡中的功能及其调控机理提供基础资料。
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