抗体免疫选择压作用下新城疫病毒HN基因和F基因的演化及其抗原性的比较分析

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将TZ060107株新城疫病毒(NDV)在CEF细胞上传代,对其HN基因和F基因分别进行扩增、克隆、测序。测序结果表明,所扩增的HN基因全长1801bp,编码区由1716bp组成,共编码571个氨基酸;所扩增的F基因全长是1725bp,编码区由1662bp组成,共编码553个氨基酸。第一个循环,TZ060107株新城疫病毒(NDV)在含有抗TZ060107抗体的鸡胚成纤维细胞(CEF)上传代,分3个独立系列连传50代,同时设3个不带抗体的独立系列也连传50代,每10代扩增HN基因和F基因并测序。第二轮循环所用的起始毒株是第50代中变异最大的A1-50系列毒株。将A1-50接种10日龄SPF鸡胚,用该尿囊液制成油乳剂灭活苗。免疫SPF鸡,2周后再次免疫,第二次免疫十天后采集抗血清。对抗血清进行病毒中和试验,根据中和试验结果确定最适血清添加浓度为1:20,用该浓度添加血清到有抗体组形成免疫选择压。将A1-50毒株在含有抗A1-50抗体的CEF培养上分3个独立系列连传50代,分别为a1、a2、a3。同时设3个不带抗体的独立传代系列作为对照,分别为b1、b2、b3。对第60、70、80、90、100代病毒的HN基因和F基因进行扩增克隆测序,结果显示有抗体组HN基因非同义突变(NS)对同义突变(S)比值为5.25,明显高于无抗体组2.375,显示出明显的抗体选择压作用。而且第一轮循环中抗体选择压下已发生的稳定非同义突变在第二轮循环中仍能稳定保持,同时出现了一个新的稳定的NS突变位点。在有抗体组经传50代后F基因发生的稳定NS突变,在第二轮循环中也仍然保持,同时也出现了3个新的稳定的非同义突变。这说明新的氨基酸取代原来抗原表位相关的氨基酸后,能形成与病毒中和反应相关的新的抗原表位。将A1-50,A2-50,A3-50毒株和TZ060107原始毒株和它们的血清分别进行HI交叉抑制试验,进行5次检测,取它们的平均值。结果显示原始毒TZ060107和3个传代衍生毒的抗原同源性较小,而3个衍生毒相互之间的同源性较大。另外再设立一组试验,将TZ060107、A1-50和a1-100抗原和阳性血清进行交叉HI试验,取5次检测值的平均。结果显示,a1-100毒株和原始毒TZ060107的抗原同源性小于A1-50和原始毒TZ060107的抗原同源性。表明随着在有抗体的CEF细胞上传代代次的增加,病毒和原始毒之间的抗原性的差异越来越大,而通过A1-50、A2-50和A3-50毒株和相应血清的HI交叉抑制试验结果可以发现相同代次衍生毒的抗原性差异不是很大。本研究通过在含有抗特定NDV毒株单因子血清的细胞上连续传代发现,相应毒株的基因发生一定程度的变化或偏离,据此推论,鸡群在饲养过程中多次接种疫苗后或者免疫程序不当等免疫压力的影响下,病毒的基因会发生变异,造成免疫逃避株的不断出现,从而使现有疫苗的免疫预防作用失效。因此本研究的结果可为临床实践中更好地制定免疫程序提供理论参考。
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