病毒性肝炎,酒精性肝病的发生率越来越高,可能出现的肝硬化及肝硬化的一系列并发症随之而来,不仅对健康造成严重影响,而且由于其慢性发展,导致治疗的长期性也给患者带来很大的不便和经济压力。常规的内科治疗只能改善临床症状,不能逆转由于肝细胞损伤导致的肝功能减退,目前只有原位肝移植能解决根本问题,但是这个治疗方案带来了一系列问题和限制。我国是一个乙肝大国,尤其是供体缺乏,费用昂贵令很多人望而却步,所以,寻求一种替代治疗迫在眉睫,成体干细胞为治疗终末期肝病提供了一个有希望的方法。近年来,再生领域的干细胞研究取得了巨大进展,国内外大量研究表明,成体干细胞具有自我更新和分化的潜力,分化为成熟的细胞以取代由于失去正常组织转化而不断丢失的成熟细胞。假定肝脏干细胞存在于骨髓中首先是由Petersen提出的,他提出在致死剂量照射的小鼠移植骨髓后发现小鼠的肝脏分化有肝脏干细胞(卵原细胞)和成熟肝脏细胞。有研究证实骨髓来源的干细胞可以在体内和体外分化为肝样细胞,目前还不清楚这些标记染色阳性的肝样细胞是否具有肝细胞的功能特征,以及向肝细胞分化的细胞是否还可以分化为中胚层细胞,如造血细胞等。Lagasse表明在小鼠骨髓表达cKit+Thy1low Sca1+ Lin–的细胞分化为肝细胞,不仅有肝细胞表型,还具有肝细胞的功能。这是干细胞用于肝病治疗的一个历史性的开端,为终末期肝病,肝脏遗传代谢性疾病的治疗带来新的希望。目的1.本研究证实G-CSF动员肝硬化病人的外周血CD34+的比例是否可以增加。2.分离、纯化的PBMC在体外增殖,在HGF、FGF-4的诱导下是否可以分化成肝样细胞。通过倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫荧光染色,Real-timePCR分析诱导的肝样细胞是否在具有肝细胞的形态同时能表达肝样细胞的表型,包括白蛋白,甲胎蛋白,细胞角蛋白18,还具有肝细胞的代谢功能如表达CYP等。3.计算外周血单个核细胞的体外分化效率,是否能为移植细胞的数量提供理论依据。方法1. G-CSF动员肝硬化病人的外周血,经血细胞分离机分离后,经流式细胞仪检测外周血单个核细胞中CD34阳性细胞的数量,并经Ficoll分离液分离提纯后体外培养。2.用M-CSF、IL-3、?-巯基乙醇培养基培养六天,在倒置相差显微镜下观察细胞的形态,数量,并在增殖六天后用肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)进行诱导,在诱导的0天,7天,14天,分别在倒置相差显微镜下观察细胞数量,形态的变化,并做免疫荧光观察细胞是否表达白蛋白(ALB),细胞角蛋白(CK)和甲胎蛋白(AFP)及表达的比率,并提取RNA行PCR检测CYP3A、ALB的表达。3.数据用均数±标准差表示,采用SPSS16.0统计软件,用统计学进行分析。结果1.G-CSF动员后肝硬化病人外周血单核细胞中CD34阳性细胞比例增加,从0.107%到0.401%。2.分离后的外周血单个核细胞在含有10%胎牛血清的1640培养基中贴壁培养,M-CSF、IL-3、?-巯基乙醇增殖六天后经HGF和FGF-4诱导,倒置相差显微镜下观察诱导7天后部分细胞形态上发生变化,呈多边形,不规则形等多种形态。14天后形态学改变较7天增加。经过免疫荧光检测和PCR检测可以表达肝样细胞的标记物ALB、AFP、CK18。荧光显微镜下,分别计算诱导7天和14天的5个高倍视野的细胞数,表达ALB的细胞数,经分析P<0.001具有统计学意义。计算出转化效率得出ALB、CK18的表达是随着时间成正比的。经PCR分析诱导14天PBMC和对照组L02肝细胞系mRNA的表达,计算P<0.001具有统计学意义。3.未诱导的对照组则呈成纤维样细胞生长,不能表达AFP、CK18但是有ALB弱阳性。结论1.G-CSF动员可以增加外周血CD34细胞数。2.体外诱导培养干细胞可以转化为肝细胞。3.干细胞向肝细胞分化的比例与时间成正比。4.移植的单个核细胞有近18%可能转化为肝细胞。5.体外未诱导的干细胞不能转化为肝细胞。本研究证实了源自动员后的肝硬化病人外周血单个核细胞不仅在体外能诱导分化成肝样细胞而且还具有肝细胞的功能。虽然分化效率尚较低,但是为临床治疗肝硬化打下了理论基础。