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miR-122是肝细胞特异表达的一种microRNA分子，在脊柱动物中高度保守，其含量占有肝细胞总microRNA库的50-70％。从发现到克隆该基因的近二十年时间里，miRNA-122的生理和病理功能研究涉及多个领域，包括肝脏代谢（主要是脂肪代谢）、免疫调控、乙肝及丙肝病毒的复制与扩增、肝脂肪化、纤维化及肝细胞肝癌的发生和发展，不仅成为相关疾病诊断和预后判断的指标，而且为这些疾病的干预和治疗提供了新的靶标。然而miR-122在正常发育过程中对肝细胞的分化和功能成熟发挥的作用及其分子基础尚不清楚。人源胚胎干细胞(hESC)体外肝向分化的研发已成为研究肝细胞分化和肝细胞功能的重要工具，获得的肝祖细胞为治疗慢性肝病以及遗传代谢性肝病提供了新的细胞来源，体外大量获取有成熟功能的肝细胞是生物人工肝制备的关键基础。本研究分别构建了miR-122可诱导过表达和miR-122敲除的hESC株，进而在体外进行肝细胞定向分化，初步探讨miR-122在hESC的肝系分化和肝细胞功能成熟过程中的发挥的作用及其机制。主要结果总结如下: (1) 利用Tet-On系统和piggyBAC转座子系统构建了可诱导过表达miR-122的hESC细胞株H1。构建的细胞株具有正常的干细胞形态、核型、多能性和体外向三个胚层分化潜能，外源加入Dox可诱导数百倍的miR-122表达。过表达miR-122的肝祖细胞和随后分化的肝样细胞，不仅形态更加规则，其功能在糖原合成、CYP3A4酶活性、尿素合成及ALB分泌等方面都显著高于对照组，提示miR-122对于肝分化及肝功能成熟发挥促进作用。 (2) 利用CRISPR/cas9编辑技术构建了miR-122杂合缺失和纯合缺失的hESC细胞株H1。这两株细胞具有正常的干细胞形态、核型、多能性和体外向三个胚层分化的能力，且未检测到脱靶位点的存在，证明miR-122位点的基因编辑特异性，并且没有破坏其多能性。miR-122敲除株的肝系分化，在内胚层干细胞和肝祖细胞效率与野生型hESC无明显差异，并可以进一步分化成90％以上白蛋白阳性的肝样细胞，但表达CYP3A4和A1AT的肝样细胞在 50％以下;其糖原合成、CYP3A4酶活性、尿素合成及ALB分泌等方面也显著低于对照组，进一步说明miR-122参与了肝祖细胞分化成肝样细胞的过程，尤其对于肝细胞的功能成熟至关重要。 (3)miR-122促进肝样细胞功能的成熟可能通过抑制非经典wnt通路和GATA4/GATA5转录因子实现。 综上所述，通过可诱导过表达及基因编辑敲除，我们从正反两方面，对miR-122在hESC的肝系分化过程中的作用进行了深入的研究，发现miR-122不参与hESC的多能性维持，内胚层干细胞及肝祖细胞的分化;miR-122部分参与了肝祖细胞分化成肝细胞的调控;对于肝样细胞的功能成熟，包括解毒、尿素合成、糖原合成及白蛋白的分泌发挥重要作用，这些促进肝功能成熟的作用可能通过非经典wnt信号通路及GATA4/5实现。本课题的不仅为理解miR-122的生理功能增添了新的知识，同时为hESC体外分化获取成熟的人源肝细胞积累了原始数据，进一步的研发，有可能为未来的生物人工肝所需的肝细胞大量生产夯实基础。