研究背景和目的在牙齿牙釉质的发育过程中,成釉细胞的功能十分重要。它既具有合成和分泌釉质基质的功能,又对其合成分泌的基质有重吸收以及降解的作用,同时它还和钙盐的转运相关,因此成釉细胞是釉质形成过程中十分关键的细胞。当外界环境或者内在营养、遗传等因素发生变化时,都有可能导致成釉细胞的分化产生异常,从而会造成牙釉质不同程度的发育不全。为了明确釉质发育过程及其影响因素,许多国内外学者针对成釉细胞的细胞学特性进行相关探索。在导致牙釉质结构异常的各种疾病原因中,由于遗传因素而不涉及全身其他疾病的异常称为遗传性牙釉质发育不全(amelogenesis imperfecta,AI)。目前我国对触的研究多局限于家族病例的报道,而国外学者对AI的病因进行了深入探索。对于导致趟的病因中,首先被确定的致病基因是编码釉原蛋白的基因。迄今为止,已发现的釉原蛋白(AMELX),釉蛋白(ENAM),金属基质蛋白酶20(MMP20)和丝氨酸蛋白酶4(KLK4)这四个致越基因的突变数目分别为15、9、4和1。但它们突变引起的舡仅占所研究越家族数目的四分之一,这说明还存在别的与趟发病相关基因[2]。很多学者也对此进行了相关研究。近来的研究开始围绕着Rho介导的信号通路在釉质发生过程中发挥的潜在调节作用[扪。Rho蛋白属于小G蛋白家族,是Ras超家族的亚家族成员。通常,我们根据Rho蛋白基因序列的同源程度和功能不同,可以将其分为RhoA、 Rac1、Cdc42及缺乏GTP酶活性等四大类。其中RhoA、Rac1、Cdc42经常被学者们作为研究的重点。Rho蛋白在信号转导过程中起主调控器的作用,大部分Rho蛋白快速转换于与GTP结合和与GDP结合这两种状态之间,即活化状态和非活化状态。因此,它能够在细胞的信号转导过程中起到“分子开关”作用。它们在调节肌动蛋白细胞骨架方面起到举足轻重的作用,同时显著影响转录因子活性、膜运输途径、细胞极性和微管动力学。即它们参与调控细胞内吞作用和胞外分泌、细胞形状和细胞与细胞相互作用,以及调控细胞极性、细胞运动等生理过程[5,61。作为Rho蛋白家族的主要成员之一,细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在与GTP结合时呈激活状态,反之与GDP相结合时则呈失活状态。在与GTP结合时,Cdc42能够激活其下游的效应因子,进而会导致一系列的细胞反应。研究显示Cdc42在细胞生长、分化、程序化死亡、细胞极性的建立等方面起到重要作用,在细胞内参与了许多重要的代谢调控过程。Cdc42能够诱导伪足等的重建,并且使肌动蛋白多聚化和组装[7],从而参与了细胞骨架的维持及重组。同时,有研究人员认为Cdc42是通过影响p21CIPI的功能从而参与调控锚定依赖性细胞的细胞周期[8],以及在细胞外因子刺激细胞引起的转录过程中发挥较重要作用。此外,Cdc42分子有助于细胞内吞作用,常发生于一些特殊的微环境。目前,尚未发现有关Cdc42蛋白在牙齿发育过程尤其釉质发育过程中具体表达情况以及发挥作用的研究报道。因此,本实验旨在明确Cdc42在小鼠牙齿发育过程中的具体表达,并且对其在小鼠成釉细胞中可能发生的作用进行初步探讨。本论文分以下四个部分内容：第一章：Cdc42在小鼠牙胚发育中的表达本实验分别获取E13.5、E15.5、E17.5及E19.5的小鼠磨牙牙胚,经过固定、脱水、透明、包埋蜡块,最后得到组织切片。将组织切片进行HE染色和组织免疫荧光检测。通过免疫荧光方法检测整个牙胚发育包括蕾状期、帽状期、钟状期、钟状晚期等过程中Cdc42的表达情况,初步了解其在牙胚发育尤其釉质发育过程中都有不同程度的表达。第二章：小鼠成釉细胞离体培养、纯化及鉴定本实验通过酶消化法体外培养小鼠成釉细胞,缩短培养时间。以基底膜抽提物包被,利于细胞贴壁及生长。并通过差速消化法,可获得纯化的成釉细胞。其纯度较高,有利于相关基础研究的进行,为小鼠成釉细胞的体外培养及纯化提供了思路。第三章：Cdc42在小鼠成釉细胞中的表达本实验通过RT-PCR从mRNA水平证实了小鼠成釉细胞中Cdc42的存在,用Western blot从蛋白水平检测了Cdc42在小鼠成釉细胞中的表达,最后通过免疫荧光进一步明确定位Cdc42主要表达于小鼠成釉细胞胞膜与胞质位置,为以后探讨Cdc42在小鼠成釉细胞中所发挥生物学功能影响奠定了基础。第四章：抑制Cdc42对小鼠成釉细胞釉基质蛋白表达的影响本实验通过运用Cdc42抑制剂ML141培养小鼠成釉细胞,达到抑制细胞中Cdc42。再通过Western blot检测小鼠成釉细胞中釉基质蛋白表达水平,从而初步探寻Cdc42对釉质发育过程可能发挥的作用。材料与方法小鼠牙胚切片的制作分别获取E13.5、E15.5、E17.5及E19.5组织标本。将标本置于4%多聚甲醛溶液中固定后,再通过50%、70%、80%、90%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%I、100%Ⅱ的乙醇溶液中按由低到高梯度浓度达到脱水目的。脱水完成的标本放入二甲苯中透明,再置于60℃的蜡中浸蜡。浸蜡后的组织按照切片需要方向包埋出蜡块。石蜡切片机上5 μm连续切片,捞片放入烤箱备用。HE染色将组织切片浸入二甲苯中脱蜡,之后依次经过由低到高梯度浓度乙醇溶液复水。苏木精染核,盐酸酒精溶液分化脱色,流水返蓝,镜下观察至合适深度后浸入伊红溶液中染色。复染好的组织切片再次经过脱水透明步骤,最后树胶封片,正置显微镜下观察。组织免疫荧光将组织切片浸入二甲苯中脱蜡,之后依次经过梯度浓度乙醇溶液复水。蒸馏水洗涤之后,运用枸橼酸钠溶液进行抗原热修复。再通过BSA封闭液封闭非特异性抗原。一抗4℃孵育过夜,二抗及Hoechst避光室温孵育后,荧光防淬灭甘油封片,荧光显微镜下观察。小鼠成釉细胞离体培养取新生小鼠脱颈处死浸泡于75%酒精中消毒后,沿上下颌骨中线将头部分为上下两部分,置于预冷无菌的D-Hanks溶液中清洗,于体视显微镜下完整分离上下颌中的第一磨牙牙胚。将牙胚收集加入0.25%含有EDTA的胰酶中,剪碎并37℃消化20 mmin,每5 mmin钟摇晃一次以促进胰酶作用均匀。将所得细胞悬液1000r/min离心5 mmin,弃去上清,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬,接种于用0.25 mg/mL Geltrex Matrix包被的培养皿中,置于37℃、50%C02饱和度和饱和湿度标准条件的孵箱中,隔天换液。小鼠成釉细胞纯化利用上皮与间充质两种细胞对胰蛋白酶耐受力的不同,取原代培养4d细胞,吸出培养基,用无菌的D-Hanks溶液清洗细胞后,加入0.25%胰蛋白酶,在倒置显微镜下观察至长梭形成纤维样细胞边缘收缩,而上皮样细胞并无明显变化,此时加入培养基中止消化,并轻轻淋洗贴壁细胞,然后加入全培继续培养。一周后重复差别消化,连续培养。细胞免疫荧光将细胞消化后并种植于细胞爬片上,培养1d后,用无菌的D-Hanks溶液清洗,4%多聚甲醛溶液室温下固定10 min, PBS溶液清洗3次,每次5 mmin,0.1% TritonX-100孵育5 min后PBS清洗,5%的BSA室温封闭1h,一抗(K14和AMELX)孵育4℃过夜,PBS洗3次,每次5一mmin,红色荧光二抗室温孵育1h, Hochest复染细胞核,最后用荧光防淬灭剂封片,荧光显微镜下观察。RT-PCR提取细胞总RNA,将RNA逆转录为cDNA后,用PCR扩增仪进行扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳跑胶,放入激光成像系统中观察。Western blot常规提取细胞的蛋白,采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的浓度,并将各样品蛋白浓度调至相同。分别配好分离胶与浓缩胶、上样、倒入电泳缓冲液进行电泳跑胶、转膜、封闭、依次孵育一二抗、最后显影液曝光,观察记录结果。统计学分析所有数值采用Mean±SD记录,应用SPSS13.0统计软件对资料进行统计分析,计量资料采用One Way ANOVA比较多组差异性,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.Cdc42在小鼠牙胚发育过程中的表达情况免疫荧光方法检测到Cdc42在小鼠牙胚蕾状期、帽状期、钟状期及钟状晚期都有表达,在釉质发育过程中在成釉器中有不同程度的表达。2.小鼠成釉细胞的离体培养及纯化原代培养的小鼠成釉细胞生长良好,其中混有大量成纤维样细胞,经改良纯化后明显好转,细胞呈铺路石样成片生长,细胞纯度较高。3.Cdc42在小鼠成釉细胞中的表达情况RT-PCR显示Cdc42 mRNA在小鼠成釉细胞中表达,Western blot显示Cdc42在小鼠成釉细胞中检测到表达,细胞免疫荧光显示Cdc42在小鼠成釉细胞中表达并定位于胞膜与胞质。4.抑制Cdc42对小鼠成釉细胞釉基质蛋白表达的影响运用Cdc42抑制剂ML141培养小鼠成釉细胞,达到抑制Cdc42的效果。通过Western blot检测到小鼠成釉细胞釉基质蛋白有不同程度的变化。结论1.Cdc42在各阶段小鼠牙胚尤其成釉器中有不同程度表达变化,表明Cdc42可能参与釉质发育过程。2.采用基底膜抽提物作为基质,酶消化法培养后经差速消化法纯化得到小鼠成釉细胞,有利于相关基础研究的进行。3.小鼠成釉细胞中表达Cdc42,其主要表达于小鼠成釉细胞胞膜与胞质,提示Cdc42与成釉细胞有密切联系。4.当Cdc42受到抑制,小鼠成釉细胞中AMELX、AMBN、MMP20以及KLK4都出现了不同程度的变化,提示Cdc42可能影响小鼠成釉细胞釉基质蛋白的表达情况。