目的以唐由之研究员经验方凉血化瘀方为干预药物,观察不同浓度凉血化瘀方中药及服用了不同剂量凉血化瘀方中药的大鼠血清(含药血清)对蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡的影响;及该药物对人视网膜色素上皮细胞吞噬作用的影响。从细胞生物学角度探讨凉血化瘀方对年龄相关性黄斑变性的疗效机制,为凉血化瘀方治疗湿性年龄相关性黄斑变性提供实验依据。方法1人RPE细胞的体外培养及鉴定:用胰酶消化法体外分离人RPE细胞,进行RPE细胞的原代及传代培养,并观察细胞生长情况。采用免疫组化法对细胞进行鉴定。2适于人RPE细胞实验的凉血化瘀方药物浓度的筛选:用CCK8法测定加入不同浓度凉血化瘀方中药粗提物及不同剂量的不同浓度凉血化瘀方含药血清共同培养的人RPE细胞的吸光度值,观察不同浓度凉血化瘀方中药及不同剂量的不同浓度凉血化瘀方含药血清对人RPE细胞活性的影响。选择适合进行人RPE细胞相关实验的药物浓度。3人RPE细胞光损伤模型的建立:采用波长范围为470～500nm,光照强度为(2000±500)LUX的蓝光对人RPE细胞进行照射12小时,诱导人RPE细胞凋亡。采用流式细胞技术,以Annexin V FITC/PI为染料观察人RPE细胞的凋亡情况。4凉血化瘀方对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡的影响:光照前加入不同浓度凉血化瘀方中药粗提物、不同剂量的不同浓度凉血化瘀方含药血清及阳性对照药物(维生素C100umol/L)。采用流式细胞技术,以Annexin V FITC/PI为染料,检测不同浓度的中药粗提物及不同剂量的不同浓度凉血化瘀方含药血清对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡的影响。并与阳性对照组进行比较。5凉血化瘀方对人RPE细胞吞噬作用的影响:用FITC标记光感受器外节膜盘(rod outer segment,ROS);用DAPI将细胞染色并进行细胞计数;将不同浓度凉血化瘀方中药粗提物及不同剂量的不同浓度凉血化瘀方含药血清干预的后的人RPE细胞与标记好的ROS共同培养12小时后;荧光显微镜照相,用Leica QWIN图像分析软件分别测量药物干预后的RPE细胞平均吞噬FITC标记后的ROS的荧光面积。结果1人RPE细胞的培养及鉴定:原代人RPE细胞培养过程中,体外分离的人RPE细胞在2～3天内可贴壁生长,生长一周左右出现细胞集落,10天左右大部分细胞呈现融合状态。原代人RPE细胞呈扁平、不规则多角形,细胞核及核仁呈透明状,胞浆内充满黑色素颗粒,由于其自身不能产生黑色素,随着传代次数的增加,胞浆内黑色素颗粒逐渐减少直至消失。传至第五代,细胞呈梭型,类似成纤维细胞。传代至第九代细胞出现增殖缓慢。免疫组化法进行细胞鉴定,S100、CK均为阳性即胞浆均呈棕黄色,未见阴性细胞。2适于人RPE细胞实验的凉血化瘀方药物浓度的筛选:观察不同浓度凉血化瘀方中药粗提物及不同剂量的不同浓度凉血化瘀方含药血清对人RPE细胞活性的影响。结果示:终浓度为2mg/ml、200ug/ml、20ug/ml、2ug/ml的凉血化瘀方中药粗提物组与未加药物组RPE细胞吸光度(OD)值比较未见明显降低,无统计学意义(P＞0.05),即这四个浓度的凉血化瘀方中药对人RPE细胞活性无影响,可以用于实验研究。终浓度为200mg/ml、20mg/ml组与未加药物组RPE细胞吸光度(OD)值比较明显降低,具有统计学意义(P＜0.01),抑制RPE细胞的活性,不适宜进行实验;终浓度为10%、20%、30%、40%的高、中、低剂量凉血化瘀方含药血清的RPE细胞组与无药血清组RPE细胞比较吸光度(OD)值比较未见明显降低,无统计学意义(P＞0.05),即对人RPE细胞的活性无明显的影响,可以用于实验。3人RPE细胞光损伤模型的建立:波长范围为470～500nm,光照强度(2000±500)LUX的蓝光照射人RPE细胞12小时,对RPE细胞的影响主要是细胞凋亡,蓝光照射可以成功建立RPE细胞光损伤模型。4凉血化瘀方对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡的影响:用Annexin V FITC/PI双染,流式细胞仪检测不同浓度凉血化瘀方中药粗提物及不同剂量的不同浓度凉血化瘀方含药血清对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡的影响。中药粗提物部分实验的结果示:在2mg/ml、200ug/ml、20ug/ml、2ug/ml的浓度范围内对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡具有保护作用,凋亡细胞数量明显少于光损伤组,具有统计学意义(P＜0.01),且优于阳性对照药组(维生素C组)。含药血清部分实验结果示:高、中、低剂量含药血清的40%、20%、10%、5%浓度组均对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡具有保护作用。其中浓度为40%、20%高剂量含药血清组及浓度为40%、20%、10%中剂量含药血清组和浓度为40%、20%低剂量含药血清组,对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡的保护作用优于阳性对照组,凋亡细胞数量明显少于阳性对照组,具有显著统计学差异(P＜0.01);浓度为10%、5%高剂量含药血清组对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡的保护作用优于阳性对照组,凋亡细胞数量明显少于阳性对照组,具有显著统计学差异(P＜0.05);浓度5%的中剂量组及浓度为10%和5%低剂量组与阳性对照组比较细胞凋亡数量无明显差异(P＞0.05)。凉血化瘀方对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡的保护作用在一定浓度范围内与药物浓度高低呈正比。在本实验研究的浓度范围内随着药物浓度的增加保护作用越明显。5凉血化瘀方对人RPE细胞吞噬作用的影响:中药粗提物部分实验的结果示:浓度为2mg/ml,200ug/ml组,人RPE细胞平均吞噬ROS的荧光面积明显大于未干预组(P＜0.01)即其吞噬ROS数量多于未干预组;20ug/ml组,2ug/ml组相对于未干预组吞噬ROS荧光面积未见明显差异(P＞0.05)。含药血清部分实验结果显示:高、中、低剂量含药血清浓度为40%的三个药物干预组的人RPE细胞平均吞噬ROS的荧光面积明显大于未干预组(P＜0.01)即其吞噬ROS数量多于未干预组;余各组相对于未干预组人RPE细胞平均吞噬ROS的荧光面积未见明显差异。本实验结果表明凉血化瘀方在较高的浓度范围内对人RPE细胞的吞噬功能有一定的促进作用。结论1胰酶消化法是成功的体外纯化培养人RPE细胞的有效方法,为建立RPE细胞相关实验模型,进行相关实验提供基础。2凉血化瘀方在本实验的浓度范围内对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡具有一定的保护作用。3凉血化瘀方在本实验的涉及的较高的浓度内有提高人RPE细胞的吞噬功能的作用。4凉血化瘀方对蓝光诱导的人RPE细胞凋亡的保护作用及其对人RPE细胞吞噬功能的促进作用可能是该复方在临床能够有效治疗湿性年龄相关性黄斑变性的部分机制,为凉血化瘀方治疗年龄相关性黄斑变性提供了体外细胞学实验依据。