结核病（tuberculosis，TB）仍然是人类健康的重大威胁。结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB，结核菌）是结核病的致病菌。拒世界卫生组织组织(WHO)估计，仅仅在2010年，大约有八百八十万人新发感染结核病，造成了约一百五十万人的死亡;此外，大约44万人的感染为耐多药结核病(multidrug-resistanttuberculosis，MDR-TB)。MDR-TB是指至少对一线抗结核药物利福平和异烟肼产生耐药性的结核。对于MDR-TB，我们只能依赖于治疗效率更低、毒副作用更大的二线抗结合药物进行治疗。然而，更为严重的是，在MDR-TB基础上另外对至少一种注射性二线抗结核药物和任何一种氟喹诺酮类药物产生耐药性的广泛耐药性结核(extensivedrug-resistantTB，XDR-TB)的出现更加增加了我们对于结核病的控制难度。注射性二线抗结核药物(SLDs)包括卡那霉素(kanamycin，KAN)，阿米卡星(amikacin,AMK)和卷曲霉素(capreomycin,CAP)对于MDR-TB的控制起着非常重要的作用。在三种注射性SLDs中，对卷曲霉素是否耐药对于MDR-TB病人的治疗预后情况非常重要。治疗TB仅仅依靠抗生素对结核菌的杀灭是远远不够的，还需要有效激活人体自身的免疫系统对结核菌的感染进行控制。细胞因子Interleukin-12(IL-12)对于结核菌感染的控制非常重要，IL-12由两个亚基组成，分别是p35和p70亚基，其中p40同时是IL-12和IL-23的组成部分。其p40亚基在单独存在情况下就能够增强宿主对于结核菌感染的保护性免疫。因此，为研究二线抗结核药物的耐药情况、卷曲霉素耐药机理和IL-12p40亚基调控的机理，本论文进行了三个部分的研究，即:第一部分:中国大陆临床分离菌株MTBrrsA1401G突变和卡那霉素，阿米卡星，卷曲霉素的高水平耐药相关;第二部分:分枝杆菌卷曲霉素新耐药基因的筛选和鉴定;第三部分:腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]调控细胞因子IL-12/23p40亚基表达的研究。　　 在论文第一部分，我们收集了114株临床分离的结核分枝杆菌菌株，测定了这些菌株对于三种SLDs的MIC(minimuminhibitoryconcentration)，并且测定了这些菌株中耐药基因rra、tlyA、eis启动子、whiB75UTR(5untranslatedregion)的突变情况。这三种药物之间存在着严重的交叉耐药情况。本研究中没有发现tlyA、eis启动子、whiB75UTR发生和耐药相关的突变。对于rrs1400区域的测序发现A1401G突变是最为广泛存在的突变。大约84％的KAN耐药菌株存在A1401G突变，而只有50％的AMK和CAP突变菌株含有这个突变。另外，几乎所有含有A1401G突变的菌株都对KAN和AMK表现出高水平耐药，而只有63％的A1401G突变菌株对CAP表现出高水平耐药。总的来说，我们的研究发现A1401G突变和KAN耐药性高度相关，这个突变可以作为预测KAN耐药的生物标志物;另外，该突变还和所有三种SLDs的高水平耐药相关，特别是氨基糖苷类药物KAN和AMK。　　 在论文第二部是，我们对分枝杆菌中卷曲霉素新耐药基因进行了筛选和鉴定。虽然目前卷曲霉素耐药机理已经研究的比较清楚，卷曲霉素是通过结合到16SrRNA和23SrRNA结合部位抑制蛋白质的翻译发挥作用，但是我们在第一部分的临床菌株中发现大约50％的卷曲霉素耐药菌株并没有在已知的靶标相关基因tlyA和rrs发生突变，提示分枝杆菌中另外存在和卷曲霉素耐药相关的基因，可能和其靶标相关。我们使用Tn5转座子构建了M.smegmatis的转座子突变库。从突变库中筛选对卷曲霉素产生耐药性的突变株。经过筛选，我们得到一个突变株(C4)，其对于卷曲霉素的MIC是野生型的4倍（20μg/ml）。C4菌落形态和野生型M.smegmatis明显不同，相对于野生型，C4菌落明显光滑。通过扫描电镜观察，我们发现C4的细胞较野生型显得臃肿且细胞长度缩短。我们通过hiTAIL-PCR鉴定了C4的转座子插入位点是MSMEG_0841基因，这个基因在NCBI里面注释为假基因，并且没有任何的同源序列。RT-PCR没有检测到MSMEG_0841的表达。我们对该基因进行了敲除和过表达，均不能改变C4的耐药性或菌落形态。通过对MSMEG0841在基因组中的位置分析，我们发现其下游基因，MSMEG_0840，可能和C4的耐药性和表型变化相关。Real-timePCR检测发现MSMEG_0840在C4中被上调表达。随后我们在野生型M.smegmatis中将MSMEG_0840进行过表达。然而，结果却显示过表达MSMEG_0840的菌株对卷曲霉素耐药性或菌落形态没有任何影响，表明该基因可能和C4的表型没有关联。因此，我们认为转座子Tn5的插入和C4的耐药性和表型没有关联，可能是C4基因组中的其他基因发生了自发突变导致了其对卷曲霉素的耐药性和菌落形态的变化。　　 我们提取C4菌株和野生型M.smegmatis的基因组进行全基因组测序。结果显示C4基因组发生了6个自发突变:其中有2个是非同义突变(non-synonymousmutation)，一个位于MSMEG_1871，另一个突变位于MSMEG_3750(ppnK)和MSMEG_3751(tlyA)的重叠部位;2个缺失突变位于MSMEG_0841和MSMEG2041;剩下2个突变为基因间序列的碱基取代突变，分别位于MSMEG_0643、MSMEG_0644基因间和MSMEG_6427、MSMEG_6428基因间。通过分析我们发现两个非同义突变可能是造成C4耐药性和表型的原因。　　 发生非同义突变的3个基因在致病性分枝杆菌中高度保守，M.tuberculosisH37Rv的Rv3904c(esxE)、Rv1694(tlyA)、Rv1695(ppnK)分别和M.smegmatis的MSMEG_1871(esxE)、MSMEG3751(tlyA)、MSMEG_3750(ppnK)有37％、77％和84％的氨基酸相同。此外，tlyA和ppnK基因分别在M.smegmatis和M.tuberculosis基因组中的邻近基因也大致相似，并且都存在这两个基因终止密码子和起始密码子重叠的现象。我们将Rv1695(ppnK)在E.coli中进行过表达并测定其对卷曲霉素的MIC。结果显示过表达Rv1695(ppnK)后E.coli对于卷曲霉素的MIC为256μg/ml，而含有空载pET28的Escherichia.coli对于卷曲霉素的MIC则为512μg/ml，说明MSMEG_3750(ppnK)和卷曲霉素耐药相关。同时，我们在野生型M.smegmatis中过表达ppnk也得到类似的结果。但是，当我们在C4中过表达ppnk时，却对C4对CAP的耐药性没有影响。可能的原因是在C4中tlyA的表达也受到影响，TlyA功能不正常对C4中CAP耐药也有重要影响。此外，以上结果还说明tlyA和ppnK都和卷曲霉素耐药相关。　　 目前已知MSMEG_3751（tlyA）的突变能够引起对卷曲霉素的耐药。PPNK催化NAD以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体，生成NADP。NAD激酶是在所有生物中唯一能够催化NADP产生的酶。NADP作为辅酶，参与了大多数的还原合成反应和很多抗氧化反应。tlyA和ppnK两个基因可能是翻译藕联，上游基因tlyA因为自发突变引起的翻译延长可能直接导致下游基因ppnK不能正常开启翻译。综上所述，本实验发现MSMEG_3750(ppnK)及其在致病性分枝杆菌中的同源基因Rv1695和卷曲霉素耐药性相关。具体的作用机理还需要进一步研究，可能和上游基因的甲基转移酶功能或其本身的NAD激酶功能相关。　　 在论文第三部分，我们研究了PARP-1调控细胞因子IL-12/23p40亚基表达的研究。已有文献报道IL12B基因(编码p40)启动子部位不同的SNP(single-nucleotidepolymorphism)，即Longallele或Shortallele，和p40的表达量有关。我们首先构建了含有不同SNP的启动子荧光素酶报告系统，发现在Lipopolysaccharides/Interferon-γ刺激下含有Longallele的12B基因启动子活性更高。我们假设有调控蛋白特异性结合到Longallele上作为促进p40的表达或结合到shortallele上抑制p40的表达。将不同SNP的探针和核蛋白进行凝胶迁移实验后发现有蛋白能够特异结合到Longallele上，并且该蛋白在不同细胞中广泛存在。进一步用不同SNP的探针进行DNA-Pulldown及二维电泳发现PARP-1是结合到SNP部位的主要蛋白之一，但奇怪的是PARP-1能够同时结合到不同的SNP。用DNA-Pulldown后得到的蛋白进行Westernblot分析进一步验证了PARP-1至少是结合到IL12B启动子SNP片段蛋白中的一个重要成员。最后，我们对PARP-1进行knockdown之后发现IL12B的启动子活性降低，显示PARP-1在调控IL12B表达的功能是作为增强子起作用，其通过结合到IL12B启动子SNP部位增加启动子的活性，但是对于含不同SNP的启动子都具有增强作用。