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烟草花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)在烟草、番茄等作物上是很重要的病害,世界各地发生普遍,中国各大烟区,均有发生,烟田发病率在5%-20%,损失严重。前人研究明确指出,植烟土壤可传播TMV。但关于烟田土壤TMV的传播效率问题,至今还未有人进行详细的研究,只是从理论上认为有传毒功能,并无详细的数据分析为支撑。本研究在建立并优化的检测TMV的LAMP快速检测方法的基础上,分别对湖南省桂阳县实验烟田烟叶和烟草根际土壤样品进行检测,并对叶片和土壤中的TMV CP核苷酸序列进行了同源性分析,明确植株中TMV的来源,根据所得数据分析土壤中TMV传播效率。为进一步验证实验结果,采集田间的携带TMV的土壤,在实验室温室内,盆栽无毒烟苗,并用优化好的LAMP方法检测叶片TMV发病情况。获得研究结果如下:1、利用E.Z.N.A.TM Soil RNA Kit提取土壤RNA,后经反转录得到c DNA,引用已报道的LAMP TMV特异性引物,优化了LAMP反应体系与条件,最终确定反应体系为:1.6μM FIPBIP,0.2μM F3B3,4.0m M Mg2+,0.25m M d NTPs,Bst DNApol(8U)1.0μL,c DNA 5.0μL。反应条件:62℃恒温水浴锅反应1h,80℃,终止反应10min。反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,成像仪中获得明亮、离散型、梯度条带;检测灵敏度为RT-PCR的10-100倍。2、在上一年TMV发病严重的烟田中移栽无毒烟苗后,用10个防虫网罩,遮盖35株烟苗,每15天采集一次叶片及相应植株根基土壤,采集3次,每次开网采集后叶片均匀喷施杀虫剂。利用E.Z.N.A.TM Soil RNA Kit提取土壤样品RNA,用EASY spin植物RNA快速提取试剂盒提取叶片样品RNA,后经反转录得到c DNA,以此为模板,用建立并优化好的LAMP方法检测田间采集的样品,得到烟草与根基土壤均带毒的植株占根基带毒总数的百分率由最初的12%,增加到96%,总烟草带毒率由最初的8.57%,增长到94.28%,增幅较大;实验室温室内,将大田采集的带有TMV的土壤,一部分直接盆栽无毒烟苗,作为实验组;另一部分高压蒸汽灭菌,盆栽无毒烟苗作为对照组1;另用实验室无菌土盆栽烟苗,作为对照组2;同样采用LAMP方法检测,结果,实验组6株,有5株检测出TMV,发病率83.33%;对照组1,有2株检测出TMV,检出率为33.33%,对照组2有1株检测出TMV,检出率为16.67%,TMV检出率较小;综合田间和温室实验数据,证明土壤有较高传播TMV效率;3、对桂阳土壤样品GYS1、GYS3、GYS6,烟叶样品GYL1、GYL2、GYL3、GYL5、GYL6、GYL7,TMV分离物的CP测序分析,结果显示,土壤样品与烟叶样品的核苷酸序列同源性在96.3%-99.4%,同源性较高;在系统进化树中,均在同一分支Ⅰ上,且与来自俄罗斯的KJ406323.1株系,越南的LN651235.1、AM412008.1,中国河南的HQ896025.2在同一分支中,有较高相似性,其中与HQ896025.2株系核苷酸序列同源性在97.1%-98.1%;进一步验证叶片组织中的TMV来自土壤;综上所述,本实验所建立的快速检测TMV的LAMP方法,不需要昂贵PCR设备,具有很强的特异性,很高灵敏度,为田间快速准确的检测土壤中的TMV,进而做好防治提供了一条便捷途径。利用该方法检测田间烟草根围土样及对应烟株中的TMV,结果显示土壤中的TMV确有较高的传播效率,经TMV CP序列同源性分析可知,叶片中TMV与土壤中TMV同源性较高,说明土壤中的TMV与叶片中的TMV为同一株系,证明烟草中的TMV来自土壤。研究结果为以后从清楚土壤中的毒源着手防治TMV引起的病毒病提供了实验依据。