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人血管生成素(Angiogenin,ANG)是123个氨基酸的单链碱性蛋白,与RNaseA有33%同一性,是核糖核酸酶超家族中独具促血管生成活性的一员。虽然ANG最初从肿瘤细胞培养上清分离到,但发现它也是正常血清中的成分,存在于多种组织和细胞中。研究表明ANG与损伤组织的修复、肿瘤转移及先天性免疫等均有密切的关系。该文通过对重组大肠杆菌表达的rhANG包涵体复性条件的优化,以提高rhANG复性效率,为rhANG的放大生产打下基础。此外,检测ANG在人小肠组织细胞中的定位及抑菌活性,为揭示ANG在肠道粘膜免疫防御中作用机制的研究提供思路。
采用超声波破碎细胞,低速离心收集包涵体,TritonX-100洗涤包涵体。分离的包涵体溶解于7mol/L盐酸胍、10mmol/LDTT。变性rhANG稀释到合适的缓冲液中使之重新折叠。分析GSH/GSSG比率、pH、蛋白浓度、低浓度变性剂、添加精氨酸、稀释方式对rhANG复性的影响。结果表明在0.1mol/LTris-HClpH7~8,还原型、氧化型谷胱甘肽比率1~5,GSH浓度为0.5~1.5mmol/L,盐酸胍为0.2~0.5mol/L,DTT为0.5mmol/L,起始蛋白浓度0.2mg/ml时,rhANG蛋白复性率为60%,较优化前提高35%。0.5mol/LL-精氨酸有助复性,减少聚集体产生。脉冲稀释复性可提高单位体积复性蛋白量。经阳离子交换层析纯化获得的rhANG具有核糖核酸酶活性和促血管生成活性。
ANG免疫组化结果显示人小肠肠隐窝基底部颗粒丰富的潘氏细胞呈强阳性,体外抑菌实验结果提示rhANG对白色念珠菌有抑菌活性,其抑菌作用受盐浓度影响。研究结果提示ANG可能在小肠粘膜先天抗感染免疫和维护正常菌群平衡中起着一定作用。