体内的肌腱由于经常承受着巨大的力学载荷,损伤是很常见的。由于肌腱自身再生能力较差,恢复损伤肌腱正常的结构和功能是运动医学领域目前最具挑战的一个问题。随着干细胞的发现,特别是近年来肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)的发现,研究者对慢性肌腱损伤的发病机制和肌腱损伤的治疗修复有了新的认识。和肌腱一样,位于其内部的TSCs也必然会承受各种力学负荷。一项体外研究发现:TSCs的分化与加载的力学负荷强度相关:适度的力学牵拉牵伸刺激可以促进TSCs向肌腱细胞分化;过度的力学牵伸刺激则会导致TSCs向非肌腱细胞(脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞)方向分化。然而,TSCs成肌腱和非成肌腱细胞分化的调控机制尚不清楚。不同的机械牵伸可以导致TSCs发生不同的形变。维持细胞形态对细胞的功能至关重要,而维持细胞形态的关键细胞内部结构是细胞骨架。细胞骨架是细胞内部紧密联系的不同蛋白纤维和各种调控蛋白构成的网架体系,对细胞的整体结构起到支撑作用,在细胞伸展、生长、对外界环境反应以及分化等生理过程中,均扮演着极其重要的角色。目前,人们对于细胞力学信号传导的分子机制仍然缺乏较深入的认识,但是有一个普遍认同的事实就是:细胞骨架在建立细胞内外环境的物理-化学信号联系及转换上起着至关重要的作用。基于上述基础,我们推测在机械牵伸诱导的TSCs分化过程中细胞骨架重塑可能发挥了重要的作用,不同的机械牵伸导致TSCs细胞骨架发生了不同的变化,进而诱导TSCs向不同的方向分化。因此,本研究将试图明确不同机械牵伸对TSCs分化及细胞骨架的影响,以及细胞骨架变化在牵拉诱导分化这一过程中的作用。目的:⑴验证明确不同机械牵伸对TSCs分化的影响;⑵观察不同机械牵伸对TSCs细胞骨架重塑的影响;⑶探讨分析细胞骨架变化在牵拉诱导TSCs分化过程中的作用。方法:⑴不同机械牵伸对TSCs分化的影响:设定不同的机械牵伸条件(1HZ;牵伸强度为4%和8%;牵伸累积总时间为12h,24h,60h),模拟tscs体内单轴循环牵伸,通过rt-pcr技术对牵伸后tscs成腱分化相关标志基因(colla1、tnc、scx)和成脂分化相关标志基因(pparγ、lpl、ap2)的表达变化进行检测。⑵不同机械牵伸对tscs细胞骨架重塑的影响:设定不同的机械牵伸条件(1hz;牵伸强度为4%和8%;牵伸累积总时间为12h,24h,60h),模拟tscs体内单轴循环牵伸,将牵伸后的细胞制作成细胞爬片,采用f-actin免疫荧光染色以及westernblot检测f-actin/g-actin比值来观察不同牵伸条件下tscs细胞骨架的变化。⑶抑制细胞骨架重塑对tscs分化的影响:筛选出cyt-d的适用浓度,在tscs成脂肪诱导培养、成肌腱诱导牵伸,以及普通完全培养基培养的过程中,加入cyt-d抑制肌动蛋白聚合,破坏细胞骨架的重塑,通过定量rt-pcr和westernblot技术对cyt-d干扰后tscs成脂和成腱分化相关标志基因、蛋白的表达变化进行检测。结果:⑴colla1、tnc、scx基因mrna的表达在频率1hz,4%的牵拉应力载荷时,三个牵拉累积总时间点均增加(p<0.05);而8%的牵拉应力载荷初期(12h)可使上述基因的mrna表达略有增加,但随着牵拉累积时间的延长(60h),上述基因的mrna表达明显降低(p<0.05)。pparγ、lpl、ap2基因mrna的表达在频率1hz,4%的牵拉应力载荷早期(12h,24h)无明显变化,但随着牵拉累积时间的延长(60h),上述基因的mrna表达明显降低(p<0.05);而8%的牵拉应力载荷则是均导致pparγ、lpl、ap2基因mrna的表达上升(p<0.05)。⑵4%的牵拉应力载荷时,相比较于对照组,tscs的细胞骨架f-actin增粗,荧光增强,f-actin/g-actin比值增加(p<0.05),且在一定的增加范围内可以与牵伸时间呈正相关。而8%的过度牵拉应力,牵伸12h时,表现为细胞骨架f-actin荧光增强,f-actin/g-actin比值增大,但是细胞骨架f-actin的伸展性较对照组有所降低;随着总累积牵拉时间的增加(24h、60h),细胞骨架f-actin荧光强度逐渐变弱,细胞伸展性明显减小,变圆,f-actin/g-actin比值也明显下降(p<0.05)。⑶cyt-d可以有效的抑制细胞骨架肌动蛋白的聚合。在tscs成脂肪诱导培养,以及普通完全培养基培养的过程中,使用cyt-d抑制细胞骨架肌动蛋白聚合会促使pparγ、lpl、ap2的mrna表达上升(p<0.05);而在tscs成肌腱诱导牵伸,以及普通完全培养基培养的过程中,使用cyt-d抑制细胞骨架肌动蛋白聚合colla1、tnc、scx的mrna表达降低(p<0.05)。结论：⑴不同的牵伸条件可使TSCs倾向于不同的系谱方向分化:适度的机械牵拉载荷促使TSCs倾向于成腱分化,而过度的机械牵拉载荷促使TSCs倾向于成脂分化。⑵不同的牵伸条件会导致细胞骨架出现不同的重塑适度的机械牵拉载荷促使TSCs细胞骨架肌动蛋白聚合增加,而过度的机械牵拉载荷则会导致TSCs细胞骨架F-actin断裂、解聚。⑶抑制细胞骨架肌动蛋白聚合会促进TSCs成脂分化,并导致适度机械牵伸对TSCs成腱分化的诱导效应消失,抑制TSCs成肌腱细胞分化。⑷在机械牵伸诱导的TSCs分化过程中,细胞骨架的变化起着非常重要的作用,它不是伴随着TSCs成脂肪细胞或成肌腱细胞分化出现的一个结果,而是调控TSCs向不同终末细胞方向分化的早期细胞内结构信号之一。该研究不仅仅有利于我们进一步认识机械牵拉对于TSCs分化方向的调控,而且对于探索机械拉伸诱导TSCs分化过程中力学信号传导机制具有重要意义,为有效的激活肌腱干细胞向指定终末细胞方向分化提供实验和理论基础,最终使TSCs能够成功的应用于临床肌腱病的预防、肌腱损伤的治疗。