帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是全球第二大老化相关的神经退行性疾病,其确切病因尚不完全清楚。PD主要病理特征为黑质致密部多巴胺(Dopamine, DA)能神经元进行性丢失及纹状体DA含量显著降低,并释有路易小体(Lewy body, LB)沉积。研究证明蛋白错误积聚、线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症、兴奋性毒性等病理机制协同促进了PD中DA神经元进行性退变。目前,PD尚缺乏有效的治疗手段,临床依然主要使用左旋多巴替代治疗,尽管左旋多巴可以减轻PD的运动症状,但不能延缓疾病的进程,长期应用还会诱发一系列不良反应。与左旋多巴相比,单独应用DA受体激动剂对早期PD患者疗效确切且显著减少副反应的发生,但对晚期或严重的PD患者效果不理想。因此,DA受体激动剂是早期PD患者治疗的首选药物。所在实验室前期研究发现星形胶质细胞DA D2受体(D2R)具有抑制神经炎症作用,D2R激动剂可减轻亚急性PD模型小鼠中脑DA神经元损伤,但其机制尚不清楚。因此,深入阐明星形胶质细胞D2R的抑炎机制,对于研发理想的PD神经保护剂和新的PD治疗学策略具有重大的科学意义。α-突触核蛋白(α-Synuclein, α-Syn)作为路易小体的主要成分,是一种表达在中枢神经系统突触前膜的可溶性蛋白,生理功能包括参与中枢神经系统(Central nevous system, CNS)突触发育、参与调节DA合成释放、参与突触前囊泡转运、参与脂质代谢及发挥分子伴侣功能等。PD病理过程中,神经元内可溶性α-syn单体异常积聚形成寡聚体,进而聚集成原纤维,最终形成纤维缠结发挥毒性作用,其中寡聚体是其主要毒性形式。近年来研究表明α-syn的毒性作用不仅仅局限在神经元内,病理状态下神经元释放至胞外的α-syn寡聚体可激活邻近的小胶质细胞和星形胶质细胞,诱导神经炎症的发生；α-Syn还能抑制神经干细胞的增殖与分化,阻碍PD的再生修复进程。目前,α-Syn寡聚体的神经毒性已被广泛认可,但α-syn单体在神经炎症和神经元损伤中扮演何种角色目前尚存争议。此外,从神经元分泌至胞浆中的α-syn能否影响PD治疗药物(如DA受体激动剂)的治疗效果,目前未见报道。在前期研究基础上,本文第一部分工作首先培养野生型(Wild type, WT)和全身过表达突变型α-syn转基因(A53Ttg/tg)小鼠原代中脑星形胶质细胞,并外源性给予LPS、MPP+及WT/A53T突变型α-syn单体蛋白刺激,发现D2R激动剂喹吡罗(quinpirole)抑制LPS及MPP+诱导的星形胶质细胞炎性反应,但对α-syn诱导的星形胶质细胞炎症无效,提示α-syn取消了星形胶质细胞D2R的抑炎作用。此外,quinpirole减轻LPS诱导的星形胶质细胞炎症所致DA能神经元损伤,但其不能改善α-syn诱导的星形胶质细胞炎症所致神经元死亡,表明α-syn也破坏了D2R激动剂的神经保护作用。在此基础上,第二部分工作进一步阐明quinpirole通过p-抑制性蛋白(P-arrestin 2, β-Arr2)介导的G蛋白非依赖的信号通路发挥抑炎作用；α-Syn通过干扰星形胶质细胞β-Arr2抑炎信号,促进TAK1-TAB1复合物形成,从而取消了quinpirole的抑炎效应。该结果提示对于PD晚期患者,选择性激活β-Arr2信号可能会提高DA受体激动剂的临床疗效,为PD神经保护治疗提供新的思路。由于神经再生障碍是神经元退行性病变的重要机制,维持神经损伤与再生修复之间的平衡是延缓PD病理进程的重要策略。因此,第三部分工作应用A53Ttg/tg小鼠,从整体、细胞和分子水平阐明α-syn介导的神经炎症抑制成年小鼠脑内神经干细胞增殖分化及其机制,并进一步发现microRNA-7通过靶向调节α-syn表达,减轻神经炎症从而促进神经再生,为研发针对神经炎症和再生的神经保护药物提供了新的靶标。第一部分D2R激动剂对α-syn诱导的星形胶质细胞炎症的作用目的：研究D2R激动剂quinpirole对α-syn、LPS及MPP+诱导的星形胶质细胞炎症的作用。方法：A53Ttg/tg小鼠星形胶质细胞预孵D2R激动剂quinpirole 10 μM 30 min,应用Real-time PCR方法检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12、IFN-y mRNA水平；Elisa检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-12的分泌；western blotting检测细胞中NF-κB炎症信号通路相关蛋白TLR4、p-IKKβ及p65的表达。应用12月龄A53Ttg/tg小鼠,分离中脑、纹状体组织,western blotting检测α-syn的表达及存在形式。培养新生1-3天A53Ttg/tg小鼠原代中脑星形胶质细胞,细胞免疫荧光双标观察GFAP和α-syn的共定位,同时western blotting检测α-syn的表达及存在形式。应用新生1-3天野生型(Wild-type,WT)小鼠,培养原代星形胶质细胞,预孵D2R激动剂quinpirole 10 μM 30 min,给予LPS100ng/ml刺激,6 h后收集细胞提取RNA,应用Real-time PCR方法检测炎症因子IL-1β、TNF-a、IL-6、IL-12、及IFN-y水平；24 h后收集细胞上清,Elisa方法检测炎症因子IL-1p、TNF-a、IL-12的分泌；24 h后收集细胞提取蛋白,western blotting检测细胞中NF-κB炎症信号通路相关蛋白TLR4、p-IKKβ及p65的表达。给予星形胶质细胞MPP+50μM刺激48 h后,收集细胞及上清,Real-time PCR和Elisa分别检测IL-1p等炎症因子的表达。WT小鼠原代星形胶质细胞预孵quinpirole 10 μM 30 min,给予外源性野生型(Wild-type,WT)和A53T突变型α-syn单体蛋白10 μg/ml刺激24 h后,Real-time PCR方法检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12及IFN-γ水平；western blotting检测细胞中NF-κB炎症信号通路相关蛋白TLR4、p-IKKβ及p65的表达。应用Real-time PCR及western blotting方法观察A53Ttg/tg小鼠及外源性给予α-syn单体蛋白刺激对星形胶质细胞胞浆、胞膜D2RmRNA水平及蛋白表达的影响。分别提取WT和A53Ttg/tg小鼠纹状体突触体,并给予WT突触体外源性α-syn单体蛋白10μg/ml孵育,应用放射性配体受体结合(Radioligand receptor binding assays,RRA)实验观察α-syn对小鼠D2R结合力的影响。培养WT小鼠原代星形胶质细胞,预孵D2R激动剂quinpirole 10μM 30 min,给予LPS100 ng/ml刺激,24 h后收集星形胶质细胞条件培养基,给予培养的WT小鼠原代中脑神经元(与神经元培养基1：2混合)孵育6 h,神经元酪氨酸羟化酶((Tyrosine hydroxylase, TH)免疫组化观察对中脑DA神经元数目及轴突长度的影响。培养WT小鼠原代星形胶质细胞,预孵D2R激动剂quinpirole 10 μM 30 min,给予WT/A53T a-syn单体蛋白(10μg/ml)刺激,24 h后收集星形胶质细胞条件培养基,给予培养的WT小鼠原代中脑神经元(与神经元培养基1：2混合)孵育6 h,神经元酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化观察对中脑DA神经元数目及轴突长度的影响。结果：1)基础状态下,A53Ttg/tg小鼠原代星形胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1p、IL-6、IL-12及IFN-γ mRNA水平及分泌显著增加,NF-κB炎症信号通路活化(TLR4、p-IKKβ及p65表达增加),quinpirole (10 μM)预孵30 min不能抑制上述炎性反应；2)12月龄WT小鼠中脑、纹状体仅检测到α-syn单体,而A53Ttg/tg小鼠中脑、纹状体既表达α-syn单体,也表达α-syn寡聚体；3)离体培养的A53Ttg/tg小鼠中脑原代星形胶质细胞只有α-syn单体表达,而未检测到寡聚体存在；4)LPS(100 ng/ml)或MPP+(50 μM)刺激后,星形胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12及IFN-γ mRNA水平及分泌显著增加,NF-κB炎症信号通路显著激活(TLR4、p-IKKβ、p65表达增加),quinpirole (10μM)预孵30 min显著抑制LPS诱导的炎症反应；5)外源性WT/A53T α-syn单体(10μg/ml)刺激WT星形胶质细胞诱导炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12及IFN-γ水平显著增高,NF-κB炎症信号通路显著激活(TLR4、p-IKKβ及p65表达增加),quinpirole (10μM)预孵30 min不能抑制α-syn单体诱导的炎性反应；6)A53tg/tg小鼠星形胶质细胞及外源性α-syn刺激的WT星形胶质细胞中D2RmRNA水平及胞浆、胞膜中D2R蛋白表达均显著增加；7)两种基因型小鼠基础状态下纹状体突触体中D2R结合力无显著差异,外源性给予WT α-syn单体蛋白孵育不影响D2R结合力；8)将LPS(100 ng)刺激的星形胶质细胞上清与WT小鼠中脑神经元共孵育,免疫组化显示TH阳性细胞数目及突起长度显著减少,quinpirole(10μM)预孵星形胶质细胞30 min后可减轻炎症引起的TH神经元减少及突起长度缩短；WT/A53T α-syn单体(10μg/ml)刺激的星形胶质细胞上清显著减少WT小鼠中脑TH神经元数目及突起长度,但quinpirole (10μM)预孵育星形胶质细胞30 min不能改善炎症诱导的TH阳性数目减少及突起长度缩短。结论：1) α-Syn单体可诱导星形胶质细胞炎性反应；2)激活星形胶质细胞D2R抑制LPS、MPP+诱导的星形胶质细胞炎性反应,但对α-syn诱导的炎性反应无效；3)α-Syn取消星形胶质细胞D2R激动剂对DA神经元的保护作用。第二部分α-Syn取消β-arrestin 2介导的星形胶质细胞D2R激动剂抑炎作用目的：阐明α-syn取消星形胶质细胞D2R激动剂抑炎作用的机制。方法：Western blotting方法观察quinpirole对星形胶质细胞aB-crystallin蛋白表达的影响。应用cAMP检测试剂盒观察quinpirole对星形胶质细胞内cAMP含量的影响；应用cAMP类似物双丁酰环腺苷酸(Dibutyryl cAMP, db-cAMP)100μM和AC激活剂forskolin 10μM, Elisa方法观察quinpirole对IL-1p分泌的影响；western blotting方法观察quinpirole对于星形胶质细胞P-Arr2蛋白表达的影响；应用siRNA方法,下调星形胶质细胞中β-Arr2表达,Real-time PCR和Elisa方法分别检测IL-1p等炎症因子的表达,同时,western blotting检测细胞中NF-κB炎症信号通路相关蛋白TLR4、p-IKKβ及p65的表达。免疫共沉淀(Co-Immunoprecitation,Co-IP)方法观察基础状态及LPS刺激的星形胶质细胞中TAB1与β-Arr2/TAK1间相互作用；western blotting检测基础状态及LPS刺激后quinpirole对星形胶质细胞p-TAK1水平的影响。Western blotting及细胞免疫荧光方法观察A53Ttg/tg小鼠及给予外源性WT α-syn单体蛋白刺激对星形胶质细胞中aB-crystallin蛋白表达的影响。应用Real-time PCR及Western blotting方法观察A53Ttg/tg小鼠及给予α-syn刺激对星形胶质细胞中β-Arr2 mRNA水平及蛋白表达的影响。A53Ttg/tg小鼠星形胶质细胞中过表达β-Arr2, Real-time PCR和Elisa分别检测IL-1p等炎症因子的表达,同时, western blotting检测细胞中NF-κB炎症信号通路相关蛋白TLR4、p-IKKβ及p65的表达。HeLa细胞中转染重组质粒pDsRed2-Cl-SNCA和pcDNA3.1-GFP-β-arrestin 2,观察α-syn和P-Arr2的胞内共定位。细胞免疫荧光双标观察A53Ttg/tg小鼠中α-syn与核H3共定位。构建pGL3-β-arrestin 2启动子荧光素酶报告基因质粒,将其与3HA-WT/A53T-SNCA质粒共同转入HeLa细胞中,荧光素酶报告基因法观察α-syn对β-Arr2启动子荧光素酶活性的影响。染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecititation, Ch-IP)观察α-syn与β-Arr2启动子的直接结合。WT小鼠星形胶质细胞预孵quinpirole 10 μM 30 min,给予外源性α-syn 10 μg/ml刺激,免疫共沉淀(Co-Immunoprecititaion, Co-IP)实验观察a-syn与β-Arr2间相互作用及α-syn对β-Arr2-TAB1间相互作用的影响,并同时western blotting观察quinpriole对α-syn诱导的p-TAK1水平改变的影响。结果：1)基础状态及LPS刺激后,quinpirole均不影响星形胶质细胞aB-crystallin蛋白表达；2)基础状态及LPS刺激后,quinpirole可减少星形胶质细胞中cAMP含量,但给予db-cAMP(100μM)与forskolin(10μM)上调cAMP水平不能取消quinpirole对LPS诱导的IL-1β分泌增加的抑制作用；3)基础状态及LPS刺激后,quinpirole均上调星形胶质细胞β-Arr2表达,应用Arrb-mus-siRNA(120 nM)下调β-Arr2表达可取消quinpirole对LPS诱导的IL-1β分泌增加及NF-κB炎症信号通路激活的抑制作用；4)quinpirole促进星形胶质细胞β-Arr2与TAB1结合,抑制LPS诱导的TAB1-TAK1相互作用,同时抑制p-TAK1水平升高；5)基础状态下,WT和A53Ttg/tg小鼠星形胶质细胞αB-crystallin蛋白表达无差异,外源性给予WT a-syn单体蛋白刺激不影响星形胶质细胞中αB-crystallin蛋白表达；6)A53Ttg/tg星形胶质细胞或外源性α-syn刺激的星形胶质细胞中P-Arr2的mRNA水平及蛋白表达均显著下调；A53Ttg/tg星形胶质细胞中过表达β-Arr2可恢复quinpirole对炎症因子IL-1β、TNF-α等及活化的NF-κB信号通路的抑制作用；7)α-Syn可以进入细胞核并显著抑制β-Arr2启动子荧光素酶活性,但核内α-syn与β-Arr2启动子没有直接结合；8)α-syn与β-Arr2存在胞浆共定位；基础状态下,α-syn可以与β-Arr2相互作用,抑制β-Arr2与TAB1结合,降低TAKl磷酸化水平。结论：1)激活星形胶质细胞D2R通过GPCR非依赖的β-Arr2信号通路,促进β-Arr2与TAB1间相互作用,抑制LPS诱导的TAB1-TAK1复合体形成,下调p-TAK1水平,阻断下游NF-κB炎症信号通路,抑制星形胶质细胞介导的神经炎症；2)α-Syn单体通过抑制β-Arr2启动子活性从而抑制其表达,或通过抑制星形胶质细胞β-Arr2-TAB1间相互作用,上调TAK1磷酸化水平从而取消quinpirole的抑炎作用。第三部分a-Syn诱导的神经炎症对成年神经再生的影响及其机制目的：研究a-syn诱导的炎症对小鼠SVZ区成年神经干细胞增殖、分化的影响及其机制。方法：应用成年WT和A53Ttg/tg小鼠,BrdU免疫组化观察两种基因型SVZ区BrdU阳性增殖细胞数目,免疫荧光标记分别观察两种基因型SVZ区Ki67阳性增殖细胞,NeuN阳性神经元,SOX2阳性干细胞,DCX阳性早期分化神经元并记数。应用BrdU免疫组化观察两种基因型SGZ区BrdU阳性增殖细胞数目,免疫荧光标记分别观察两种基因型SGZ区DCX阳性早期分化神经元及NeuN成熟神经元并记数。Iba-1免疫组化标记两种基因型小鼠基础状态下SVZ区小胶质细胞,并应用Real-time PCR检测SVZ区组织中细胞因子IL-1p、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α mRNA水平。Western blotting方法检测两种基因型小鼠基础状态下SVZ区NF-κB炎症信号通路(TLR4、 p-IKKβ及p65)及NLRP3炎症信号通路(NLRP3. caspase-1及IL-1β)活化情况。应用WT和α-syn敲除(α-syn-/-)小鼠,western blotting检测基础状态下两种基因型小鼠SVZ区和SGZ区NLRP3炎症信号通路(NLRP3、caspase-1、IL-1β)活化情况。离体分离培养WT和A53Ttg/tg小鼠SVZ区成体干细胞球,计数基础状态下两种基因型小鼠神经干细胞球的数目与直径。应用免疫细胞荧光方法观察两种基因型小鼠基础状态下干细胞球α-syn及Nestin阳性干细胞表达。应用Real-time PCR方法检测WT成年干细胞中炎症小体组分NLRP3、NLRP1、NLRC4及AIM2的水平。应用BrdU和Tuj1免疫细胞荧光标记两种基因型小鼠离体干细胞增殖和分化情况。Western blotting方法检测基因型小鼠离体干细胞中NF-κB炎症信号通路(TLR4、p-IKKβ、p65)及NLRP3炎症信号通路(NLRP3、caspase-1、IL-1β)活化情况。给予WT小鼠SVZ区成年干细胞外源性A53Tα-syn单体10μg/ml刺激,应用BrdU和Tuj1免疫细胞荧光标记方法观察TLR4抑制剂CLI-095及caspase-1抑制剂zYVAD对干细胞增殖及分化的影响。应用WT和caspase-1敲除(Casp-1-/-)小鼠,制备MPTP亚急性PD模型,BrdU免疫组化观察两种基因型小鼠SVZ区干细胞增殖情况。离体培养WT和Casp-1-/-小鼠成年干细胞：计数基础状态下两种基因型小鼠神经干细胞球的数目与直径；给予两种基因型干细胞外源性A53Tα-syn单体10μg/ml刺激,应用BrdU和Tuj 1免疫细胞荧光标记方法观察干细胞增殖及分化情况。制备A53Ttg/tg;Casp-1-/-双杂交小鼠,BrdU免疫组化观察基础状态下A53Ttg/tg小鼠与双杂交小鼠SVZ区干细胞增殖情况。应用Real-time PCR方法观察WT和A53Ttg/tg小鼠基础状态SVZ区组织及离体分离的干细胞中microRNA-7 (miR-7)水平。WT和A53Ttg/tg小鼠SVZ区离体成年干细胞中转染miR-7 mimics 100 nM:western blotting方法检测α-syn、TLR4、NLRP3及IL-1β表达；BrdU和Tuj 1免疫细胞荧光标记转染miR-7 mimics对A53Ttg/tg小鼠干细胞增殖和分化的影响。给予A53Ttg/tg小鼠SVZ区侧脑室注射miR-7 mimics: western blotting方法检测α-syn、NLRP3、IL-1β表达；BrdU免疫组化观察miR-7对SVZ区干细胞增殖的影响；Tuj1免疫细胞荧光观察miR-7对SVZ区干细胞分化的影响。结果：1)基础状态下,A53Ttg/tg小鼠SVZ、SGZ区BrdU+增殖干细胞、DCX+早期分化神经元数目均显著低于WT小鼠；2)A53Ttg/tg小鼠SVZ区Iba-1+小胶质细胞显著增殖活化,促炎因子IL-1p、IL-6、IL-12及TNF-α水平显著增高,抑炎因子IL-10水平显著降低；NF-κB炎症信号通路(TLR4、p-IKKβ、p65)及NLRP3炎症信号通路(NLRP3、caspase-1、IL-1β)显著激活；3)WT和α-syn-/-小鼠SVZ、SGZ区NLRP3炎症信号通路各组分表达没有差异；4)A53Ttg/tg小鼠离体分离的SVZ区成年干细胞球数目与直径均显著低于WT小鼠；5)成年小鼠干细胞中表达炎症小体NLRP3、NLRP1、NLRC4及AIM2各组分,且NLRP3丰度最高；6)A53Ttg/tg小鼠SVZ区成年干细胞BrdU+干细胞增殖数目及Tuj1+神经元分化比例均显著低于WT小鼠；同时NF-κB炎症信号通路(TLR4、p-IKKβ、p65)及NLRP3炎症信号通路(NLRP3、caspase-1、IL-1β)显著激活：7)TLR4抑制剂CLI-095及caspase-1抑制剂zYVAD可以减轻外源性A53T α-syn单体(10μg/ml)刺激对BrdU+干细胞增殖数目及Tuj1+神经元分化比例的抑制,且两者联用效应更强；8)Casp-1敲除缓解MPTP诱导的小鼠SVZ区BrdU阳性数目减少；A53tg/tg;Casp-1-/-双杂交小鼠SVZ区BrdU阳性数目较A53Ttg/tg小鼠显著增多；Casp-1敲除不影响离体培养的成年干细胞球数目与直径；Casp-1敲除减轻外源性A53T a-syn单体(10 μg/ml)刺激对SVZ成年干细胞BrdU+干细胞增殖数目及Tuj1+神经元分化比例的抑制；9)A53Ttg/tg小鼠SVZ区组织及离体培养的成年干细胞中miR-7表达显著降低；转染miR-7 mimics显著抑制A53Ttg/tg小鼠离体培养的成年干细胞中α-syn、TLR4、NLRP3、IL-1p表达；转染miR-7 mimics显著增加A53Ttg/tg小鼠成年干细胞中BrdU+干细胞增殖数目及Tuj1+神经元分化比例；10)SVZ区侧脑室注射miR-7 mimics显著抑制A53Ttg/tg小鼠SVZ区α-syn、 NLRP3、IL-1β表达；侧脑室注射miR-7 mimics显著增加A53Ttg/tg小鼠SVZ区BrdU阳性细胞数目及Tuj1+神经元分化比例。结论：1)α-Syn过表达激活小鼠SVZ区成年神经干细胞内TLR4/NF-κB和NLRP3/caspase-1炎症信号通路,促进IL-1p生成,抑制神经干细胞增殖、分化；2)miR-7靶向抑制小鼠脑内α-syn表达,减轻神经炎症反应,促进成年神经再生。综上所述,本文工作的主要创新之处在于：1.发现α-syn取消星形胶质细胞D2R激动剂抑炎效应及神经保护作用研究发现α-syn单体即可诱导星形胶质细胞炎症；激活星形胶质细胞D2R可抑制LPS及MPP+诱导的星形胶质细胞炎性反应,但对α-syn诱导的星形胶质细胞炎症无效,为临床上PD早期患者使用DA受体激动剂疗效佳,而晚期患者应用效果差积累了学术基础。2.阐明β-Arr2信号介导星形胶质细胞D2R激动剂的抑炎作用研究进一步阐明D2R激动剂通过G蛋白非依赖的β-Arr2信号发挥抑炎效应；α-Syn在胞内结合β-Arr2、阻止β-Arr2-TAB1-TAK1抑炎信号复合体的形成,进而取消了quinpirole的抗炎作用,提出对于PD晚期患者,选择性激动(3-Arr2信号级联反应可能会提高D2R激动剂临床疗效并减少其副作用,为开发新一类PD神经保护药物提供了理论依据。3.揭示α-syn通过诱导神经炎症,抑制PD进程中的神经再生研究从整体、细胞和分子水平阐明α-syn诱导的神经炎性反应介导PD神经再生损伤,从而参与PD发生发展,并揭示miR-7通过转录后调控α-syn表达从而抑制炎症并发挥神经修复功能,为靶向神经炎症的药物在PD神经保护治疗中的应用积累了实验基础。