生物能源高产菌种的选育及其产能特性的研究

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在以石油为代表的不可再生的各类矿物质资源的日益短缺的全球环境下,燃料乙醇是公认的最有发展前景的可再生清洁能源之一。以木质纤维素类生物质生产燃料乙醇不仅能够改善传统燃料乙醇“与人争粮”的尴尬现状,在降低原料成本的同时,还在废物处理、环境保护等方面起到一定的作用。木质纤维素的成分是纤维素、半纤维素和木质素,纤维素、半纤维素占总质量的70%。纤维素和半纤维素是可产生燃料乙醇的物质,但它们必须经过水解分别形成六碳糖和五碳糖后,才能被微生物利用,发酵生产乙醇。在植物纤维水解液中,戊糖占30%左右,而戊糖的主要成分是木糖,如果有效力利用植物纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇,能使木质纤维素原料的乙醇发酵的产量在原有的基础上增加25%。然而,传统上用于乙醇发酵生产的微生物如酿酒酵母和运动发酵单抱菌虽然能够很好地利用六碳糖(葡萄糖),但均不能代谢五碳糖,因此,木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节之一,而选育高糖利用率的木糖发酵菌种也一直是该领域的热门课题。   本论文以微生物学的理论为基础,根据木糖发酵菌的生活环境特点,从自然环境中分离筛选出一株发酵木糖产乙醇的菌株,应用菌株的外观形态特性和分子生物学手段对该菌株进行了鉴定。并对其菌种发酵条件进行优化,以增加其木糖发酵产乙醇的能力。最后对菌株进行了紫外线诱变,以筛选出高产乙醇的菌株。主要研究结果如下:   1、采用以木糖为唯一碳源的平板分离法,结合TTC法,从多年腐殖质土壤中筛选出5株木糖发酵菌株,分别在木糖发酵液中进行木糖发酵实验,以乙醇产量为指标,综合考虑木糖利用率和木糖转化率,根据检测结果,最终筛选出一株木糖发酵菌株,命名为4-8。   2、对该株菌进行形态学鉴定,根据实验结果,参照《酵母菌的特征与鉴定手册》,鉴定4-8号菌为酵母;同时利用分子生物学手段,对4-8号菌的18s rDNA进行测序和鉴定,结果表明,该菌株与假单丝酵母属(Candida)的麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)相似性达99%。   3、本实验筛选出的麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)在150r/min、30℃、接种量12%、初始pH值6.0的条件下,发酵木糖的最大乙醇产量为4.88 g/L,木糖转化率也最高,为理论值的24.3%。当pH接近中性,高温40℃时,该菌仍能很好的发酵木糖产乙醇,这为实验室今后利用该菌在偏碱高温环境下与纤维素降解菌的共发酵提供了可能,也为生物质能源的进一步开发利用打下了基础。   4、实验还利用紫外线对麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)进行诱变处理,提高其乙醇产量。结果表明,在麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)致死率为70%-80%的条件下,麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的乙醇产量提高了近50%,达到6.455g/L,木糖的利用率为86.92%,木糖转化率达理论值的32.29%。文章最后对发展纤维乙醇燃料产业进行了可行性分析,对中国的纤维乙醇燃料的发展提出了合理的建议。   目前人们研究最多且最有工业应用前景的3种酵母菌种的木糖转化率占理论百分比分别为,管囊酵母(Pachysolen tannophilus)37.3%(乙醇产量6.2g/L),树干毕赤酵母(Pichiastipitis)35.2%(乙醇产量5.9g/L)和休哈塔假丝酵母(Candida shechatae)34.3%(乙醇产量24.0g/L)。本论文使用在自然条件下筛选出来的野生酵母菌进行木糖的乙醇发酵,乙醇产量达6.455g/L,木糖的利用率为86.92%,木糖转化率达理论值的32.29%。可见本实验自然筛选出的麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)对于发酵木糖产燃料乙醇具有一定的竞争力和使用价值。   近年来,生物质质燃料乙醇的研究和应用取得了很大的进展,燃料乙醇的生产成本大幅度降低,但燃料乙醇的最后生产仅是整个生物质加工工程的一部分,采用生物学方法综合利用可再生生物质获取多种产品和能源是未来不可阻挡的发展方向。本文从自然界中直接分离筛选出了一株能很好利用木糖产乙醇的酵母--麦芽糖假丝酵母(Candida maltasa),并通过其发酵性能的研究和紫外诱变的方法提高了该菌的木糖发酵率,这为本实验研究解决木质纤维素水解产物中戊糖利用的问题打下了基础,也为燃料乙醇的工业化生产提供了理论依据。
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