复方中药牛黄天龙饮对人卵巢癌SK细胞和小鼠肉瘤S-180细胞抗肿瘤作用的实验研究

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目的:卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的健康。目前临床的治疗手段以手术加化疗为主,对病人的创伤较大,术后易复发,化疗副作用严重,且易产生耐药。本实验根据祖国医学知识,组创了治疗卵巢癌的复方中药“牛黄天龙饮”,观察其急性毒性试验,为长期毒性试验和临床应用提供实验依据,并观察其对BALB/C裸鼠荷瘤小鼠(人卵巢上皮性癌SK细胞)及昆明种荷瘤小鼠(小鼠肉瘤S-180细胞)实体瘤的抑瘤作用,并通过透射电镜观察肿瘤凋亡细胞的形态学改变,应用流式细胞检测仪检测肿瘤细胞的凋亡率,探讨复方中药“牛黄天龙饮”对人卵巢上皮性癌SK细胞和小鼠肉瘤S-180细胞的抑制生长机制。方法:1.应用中药药理急性毒性试验方法,不同浓度复方中药“牛黄天龙饮”煎剂对小鼠一次性灌胃,观察其中毒表现和死亡情况,并根据小鼠死亡情况,计算出“牛黄天龙饮”的半数致死量(LD50)。2.把人卵巢癌SK细胞株种植到30只BALB/C裸鼠体内,把小鼠肉瘤S-180细胞株种植到50只昆明小鼠体内,造成实体瘤模型,荷瘤小鼠随机分为5组,分别为实验组(高、中、低浓度中药)、空白对照组和阳性对照组。然后用不同浓度中药对实验组荷瘤小鼠灌胃,对空白对照组荷瘤小鼠给予等量生理盐水,阳性对照组腹腔给药,观察不同浓度的中药对人卵巢癌SK细胞和小鼠肉瘤S-180细胞实体瘤的生<WP=4>长抑制作用。3.通过透射电子显微镜观察人卵巢癌SK细胞实体瘤组织凋亡的超微结构变化,并应用流式细胞仪检测人卵巢癌SK细胞实体瘤组织,观察中药对人卵巢癌SK细胞的凋亡诱导和抑制生长机制。结果:1.复方中药“牛黄天龙饮”的急性毒性试验所得0%和100%估计半数致死量的范围为40g/kg~90g/kg,用改良寇氏法获得Xm值(最大剂量组剂量的对数值)为4.9063,∑p值(各组动物死亡率之总和)为2.2,∑p2值(各组动物死亡率平方之总和)为1.8,i值(相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数)为0.0611,计算出的半数致死量(LD50)为58.5g/kg,LD50的95%可信限为55~62g/kg。根据《中药新药研究指南(1994-0198)》第二章急性毒性试验结构评价标准,经口毒性为基本无毒。2.复方中药“牛黄天龙饮”高、中、低浓度煎剂对BALB/C荷瘤裸鼠(人卵巢癌SK细胞)体内实体瘤组织的的抑瘤率分别为:78.27%、71.36%和41.77%。中浓度组和高浓度组抑瘤率没有显著差别(P>0.05),但两者的抑瘤率都和低浓度组有显著性差别(P<0.01),高、中、低三个浓度中药实验组的肿瘤重量与空白对照组的比较,均有显著性差异(P<0.01)。复方中药“牛黄天龙饮” 高、中、低浓度煎剂对昆明种荷瘤小鼠(小鼠肉瘤S-180细胞)体内实体瘤组织的抑瘤率分别为:46.09%、44.95%和37.12%。中浓度组和高浓度组抑瘤率没有显著差别(P>0.05),但两者的抑瘤率都和低浓度组的有显著性差别(P<0.05),高、中、低三个浓度实验组的肿瘤重量与空白对照组的比较,均有显著性差异(P<0.05)。结果表明不同浓度中药均对人卵巢癌<WP=5>SK细胞和小鼠肉瘤S-180细胞有一定的抑制生长作用。3.用透射电镜观察到空白对照组和不同浓度中药实验组对人卵巢癌SK细胞实体瘤组织细胞凋亡的超微形态学改变分别为,空白对照组的正常肿瘤细胞形态为细胞核大,核质比例失调,核畸形明显,奇形怪状,有一个大而明显的核仁,细胞器较少。低浓度中药实验组的凋亡肿瘤细胞形态为细胞形态更加不规则,细胞膜皱缩,核膜局部向外突起,出现核凝聚,核异染色质边集在核膜下,有的形成半月。中浓度中药实验组的凋亡肿瘤细胞形态除上述表现外,同时出现胞质浓缩,染色变深,细胞内游离核糖体和线粒体等细胞器增多,线粒体常聚集在胞质一侧,结构异常,表现为肿胀、嵴紊乱、结构不清、密度低,或空泡状,甚至崩解。高浓度中药实验组的凋亡肿瘤细胞形态为出现核固缩,部分核膜外层溶解、消失,异染色质块裂解为大小不等的核碎块,被内质网和核膜包裹成自噬体。结果显示,复方中药“牛黄天龙饮”对BALB/C荷瘤裸鼠(人卵巢癌SK细胞)的肿瘤细胞有一定的诱导凋亡作用,且随着药物浓度的增大,细胞凋亡的形态改变越明显。4.流式细胞技术检测高、中、低不同浓度中药实验组对人卵巢癌SK细胞实体瘤组织凋亡率的结果分别为:17.9±2.31%、12.9±1.75%和11.5±2.01%。流式细胞技术检测空白对照组对人卵巢癌SK细胞实体瘤组织凋亡率的结果为3.36±1.16%。不同浓度实验组均可见到凋亡小峰;并且S和G2M期的细胞减少,细胞被阻止在G0/G1期,高、中、低浓度中药实验组的细胞增殖指数(PI)分别为29.39±2.34%、31.80±1.87%和31.96±1.65%,三个浓度中<WP=6>药实验组与空白对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。表示不同浓度中药均明显抑制人卵巢癌SK细胞DNA的合成,抑制细胞的增殖,且药物浓度越高,抑制率越高。结论:复方中药“牛黄天龙饮”的急性毒性试验经口毒性为基本无毒;其对荷瘤小鼠(人卵巢癌SK细胞株和小鼠肉瘤S-180细胞株)实体瘤组织具有明显抑制生长作用;抑制肿瘤细胞生长的主要机理为诱导细胞凋亡。表明该方药在临床有一定的应用前景,可为临床治疗卵巢癌提供一种新的途径。
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