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研究背景肝纤维化是常见的病理状态,是多种原因导致的慢性肝损伤所致的病理改变,表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的积聚。肝纤维化是对慢性肝损伤愈合和疤痕形成的应答,并且可能进展为肝硬化、肝癌和肝衰竭。然而,迄今在肝纤维化防治方面尚无十分有效的方法,因此有必要对肝纤维化发生的具体分子机制进一步进行深入研究。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),又称贮脂细胞,是肝纤维化发生过程中产生ECM的主要细胞,HSC活化被认为是肝纤维化发生的关键环节。近年来,表观遗传学改变对肝纤维化相关基因表达及HSC活化的影响日益受到重视,其中,miRNAs(micro RNAs)这一表观遗传调控机制在许多生物学过程和代谢稳态中起重要作用,包括蛋白质分泌和脂肪酸代谢等。研究表明,miR-30a、miR-9-5p、miR-142-3p等多种miRNA可以促进或抑制HSC活化。因此,研究miRNA在HSC激活中的作用对抑制甚至逆转肝纤维化有着重要意义。清道夫受体B类I型(scavenger receptor class B type I,SR-BI)是清道夫受体蛋白的B类家族的成员,编码SR-BI的基因已被命名为清道夫受体B类成员1(scavenger receptor class B member 1,SCARB1)。SR-BI可介导选择性脂质摄取并且在逆向转运胆固醇中起关键作用。SR-BI可受不同核受体和转录因子的调控,包括过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs),肝X受体(liver X receptor,LXR),肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1)和胆固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBPs)等,而这些核因子及其相关分子可通过影响炎症及脂质代谢等参与肝纤维化进程。但SCARB1在肝纤维化进程中的作用机制尚未见报道。本组前期研究发现,miR-185在肝纤维化患者外周血中上调,可作为诊断肝纤维化的外周血循环标记物,并且相关文章已经发表。为进一步研究miR-185促进肝纤维化发生发展的具体机制,我们利用生物信息学分析和双荧光素酶报告实验筛选并验证SCARB1为miR-185的靶基因,成功构建了干扰SCARB1表达的稳定细胞株,并在人肝星状细胞(LX-2)中证实了miR-185靶向SCARB1影响HSC活化并促进肝纤维化进程,为临床防治肝纤维化提供一条新的途径。第一部分:miR-185靶基因的筛选及验证研究目的:筛选及验证miR-185的靶基因研究方法:1、通过Targetscan、miRWalk、miRDB等miRNA靶点预测软件预测分析miR-185的靶基因。2、在HEK293工具细胞中对miR-185与SCARB1的靶向关系检测:构建载有SCARB1的野生型或突变型质粒,与miR-185共转染293T细胞,转染72h后应用荧光素酶报告系统检测双荧光素酶表达的差异,筛选出miR-185的直接作用靶点。3、HSC中miR-185与SCARB1的靶向关系验证:用miR-185mimic及miR-185inhibitor转染HSC,利用qRT-PCR方法和Western blot方法检测上调或者下调miR-185后SCARB1表达水平的变化以及肝星状细胞活化标志物?型胶原(Type?collagen,col?)与α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的变化。研究结果:1、miRNA靶点预测软件预测发现SCARB1与miR-185在3’-UTR区域有结合位点,可能是miR-185的靶基因。2、靶基因鉴定结果:共转染SCARB1野生型质粒和miR-185过表达质粒的细胞中双萤光素酶比值降低,差异有统计学意义,表明miR-185对SCARB1有直接调控作用,并抑制其表达。3、HSC中miR-185与SCARB1的靶向关系验证结果:与空白组和阴性对照组相比,HSC中转染miR-185 mimic之后SCARB1的表达量减少,col?和α-SMA的表达量增加,而空白组与阴性对照组相比,SCARB1、col?和α-SMA的表达量无显著差异;与空白组和阴性对照组相比,HSC中转染miR-185 inhibitor之后SCARB1的表达量增加,col?和α-SMA的表达量减少,而空白组与阴性对照组相比,SCARB1、col?和α-SMA的表达量无显著差异。结论:1、生物学信息预测SCARB1为miR-185的靶基因。2、荧光素酶报告鉴定SCARB1为miR-185的靶基因。3、上调miR-185可促进HSC活化,下调miR-185可抑制HSC活化。第二部分:miR-185靶向SCARB1促使HSC活化的机制研究研究目的:阐明miR-185靶向SCARB1促HSC活化/肝纤维化进程的生物学机制。研究方法:1、构建三个干扰SCARB1表达的稳定慢病毒细胞株sh1、sh2、sh3,利用qRT-PCR检测三个稳定株的干扰效率。挑选出干扰效率最高的细胞株进行后续实验。2、回复实验:利用qRT-PCR、Western blot方法检测SCARB1干扰稳定株组、SCARB1干扰稳定株内转染miR-185 inhibitor组HSC中SCARB1表达及HSC活化指标col?和α-SMA的表达水平。3、CCK8增殖实验明确miR-185是否靶向SCARB1影响HSC活化。4、凋亡实验明确miR-185是否靶向SCARB1影响HSC凋亡。研究结果:1、稳定株筛选结果:用qRT-PCR方法检测sh1、sh2、sh3三个不同干扰细胞株中SCARB1的干扰效率。sh1干扰稳定细胞株SCARB1的干扰效率最高,因此选为下一步实验过程中的SCARB1干扰稳定细胞株。2、回复实验结果:与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,SCARB1干扰稳定株组内SCARB1的表达明显下降,col?和α-SMA的表达明显增加;SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor后,与SCARB1干扰稳定株组相比,SCARB1的表达增加,col?和α-SMA下降,进一步验证了miR-185靶向SCARB1促进HSC活化/肝纤维化的作用。3、CCK8增殖实验结果:(1)与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,转染SCARB1干扰慢病毒稳定株组细胞在转染24 h、48 h、72 h和96h显著增殖。(2)SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor后,与SCARB1干扰稳定株组相比,细胞增殖在转染24 h、48 h、72 h和96h被抑制,有统计学差异。4、凋亡实验结果:(1)与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,转染SCARB1慢病毒干扰稳定株48h后细胞凋亡减少,有统计学差异。(2)SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor 48h后,与SCARB1干扰稳定株组相比,细胞凋亡增加。结论:1、成功构建干扰SCARB1稳定表达的细胞株。2、miR-185通过靶向SCARB1促进HSC活化,进而促进肝纤维化的发生发展。3、干扰SCARB1基因表达可以促进HSC增殖。4、干扰SCARB1基因表达可以抑制HSC凋亡。