【摘 要】
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目的构建LV-eIF3d-shRNA质粒并研究eIF3d敲减后对肺癌细胞的影响。方法通过数据库筛选针对目的基因的siRNA序列的相关信息。序列设计并合成后,通过Ecor I和Bam HI位点将目标序列克隆入p GP载体,并测序确定序列。共转染病毒包装颗粒和shRNA质粒至293T细胞,在48h后收集培养基,将收集到的培养基进行过滤、离心、浓缩,并测定滴度。将肺癌细胞A549和95D分为实验组和对照
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目的构建LV-eIF3d-shRNA质粒并研究eIF3d敲减后对肺癌细胞的影响。方法通过数据库筛选针对目的基因的siRNA序列的相关信息。序列设计并合成后,通过Ecor I和Bam HI位点将目标序列克隆入p GP载体,并测序确定序列。共转染病毒包装颗粒和shRNA质粒至293T细胞,在48h后收集培养基,将收集到的培养基进行过滤、离心、浓缩,并测定滴度。将肺癌细胞A549和95D分为实验组和对照组。实验组:用LV-eIF3d-shRNA质粒转染对应细胞;对照组:空白慢病毒质粒转染对应细胞。转染后,进行以下实验:1、釆用q PCR和Western blot分别检测细胞中eIF3d-m RNA和相应蛋白的表达量;2、利用MTT实验检测各组细胞的增殖能力;3、克隆形成实验检测群落形成能力。4、Transwells实验和划痕实验检测各组细胞的迁移能力。5、流式细胞术检测细胞周期变化;6、蛋白质芯片技术检测下游分子表达。结果经基因测序确认,重组质粒序列正确。通过GFP表达观察,显示转染效率超过90%。滴度测定结果:sh Con:7.0×106Tu/ml;sheIF3d（S1）:1.3×1 06Tu/ml;sheIF3d（S2）:7.0×106Tu/ml,符合后续实验要求。在A549和95D中;证实实验组细胞中eIF3d的m RNA和相应蛋白的表达量较对照组明显下调;MTT实验和克隆形成实验结果显示实验组细胞的增殖和群落形成能力减弱;Transwells实验和划痕实验显示细胞迁移能力也受到明显抑制;流式细胞术结果显示实验组细胞发生了G2/M期阻滞。蛋白质芯片结果显示敲减eIF3d后影响了AKT,HSP27和SAPK/JNK的激活。结论LV-eIF3d-shRNA质粒构建成功。eIF3d与人肺癌细胞株A549和95D中,起到了癌基因的作用。通过下调eIF3d的表达可降低细胞的增殖和迁移能力,影响细胞周期,以及相关信号通路的激活。
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