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背景:近年来非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病率明显上升,西方发达国家的年发病率高达20%-40%,在中国发病仅次于病毒性肝病,且有极大可能发展至肝硬化、肝癌以及肝功能衰竭,危及生命。报道显示,与普通人群相比,脂肪肝患者的心血管疾病死亡率较高。因此,NAFLD是人类健康的一大严重威胁。且NAFLD的临床表现轻微,无特异性表现,诊断多依赖实验室检查,也无批准的单药治疗方案,因此对NAFLD的发病机制进一步研究以寻找有效的分子标志物用于NAFLD的早期筛查,并发现新的治疗靶点予以针对性治疗,这对提高早期诊断率及改善预后意义重大。肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR),首次发现是定位于肝细胞浆,具有促进细胞增殖、抗细胞凋亡,调节免疫,逆转肝脏纤维化等作用的一种非特异性细胞因子。ALR在体内发现有三种分子片段:15KD、21KD和23KD。15KD是23KD的C′末端片断,即15KD ALR无信号肽序列,目前研究23KD ALR主要是在线粒体功能活动发挥作用。已有研究表明特异性敲除小鼠23KD的ALR基因后,肝脏的脂肪性肝炎及肝癌的发病率明显增加,而且在NAFLD的病人肝组织标本检测中发现23KD ALR的表达较正常人肝是下调的,说明23 KD ALR在NAFLD的发生发展中起重要作用,而15KD ALR作为23KDALR的剪切片段,目前国内外研究中暂无报道其在NAFLD中的生物学作用。因此,本实验主要构建重组15KD ALR腺病毒及探讨过表达ALR对软脂酸诱导Hep G2细胞脂肪变性的作用,为NAFLD的诊治提供新的思路。本研究包括两个部分:第一部分:重组Ad-m ALR和Ad-h ALR的构建和鉴定目的:重组腺病毒含肝再生增强因子(ALR)基因的构建。方法:基因重组法构建重组穿梭载体(p Ad Track-TO4-m ALR和p Ad Track-TO4-h ALR),重组腺病毒(Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR)采用同源重组法构建,4轮扩增后获得高低度重组腺病毒。感染L02细胞,通过荧光蛋白的表达了解其感染率,ALR蛋白表达情况和其增殖活性则通过Western Blotting法和CCK-8法检测。结果:1.重组腺病毒(Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR)被构建成功。2.重组腺病毒(Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR)能高效感染并稳定表达于L02细胞。3.与非感染组和空载病毒组相比,过表达ALR均能促进L02细胞的增殖。结论:成功构建重组腺病毒Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR,细胞实验证实15KD ALR对L02细胞具有促增殖作用。第二部分:过表达ALR在软脂酸诱导Hep G2细胞脂肪变性中的作用目的:观察过表达15KD ALR在软脂酸(palmitic acid,PA)诱导Hep G2细胞脂肪变性的作用,并简要探讨其机制。方法:本实验分为5组:未感染腺病毒且无PA处理的Hep G2细胞组(G2-NC-No infection),感染空载病毒无PA的Hep G2细胞组(G2-Ad-GFP-NC),感染空载病毒有PA的Hep G2细胞组(G2-Ad-GFP-PA),,感染Ad-GFP-h ALR无PA的Hep G2细胞组(G2-Ad-GFP-h ALR-NC),感染Ad-GFP-h ALR有PA的Hep G2细胞组(G2-Ad-GFP-h ALR-PA)。甘油三酯(Triglyceride,TG)酶法和尼罗红染色法定量和定性检测胞内脂滴储积情况,Real Time-PCR和Western blotting法被应用于细胞内固醇类调节原件结合蛋白-1(SREBP-1),脂肪分化相关蛋白(ADRP)和过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)的检测,流式细胞仪检测凋亡率,Western Blotting法检测MAPK通路相关蛋白。结果:1.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-h ALR-NC相比,实验组G2-Ad-GFP-PA的TG的测定是明显增加的,脂滴的红色荧光强度是显著增强的。而与G2-Ad-GFP-PA组相比,过表达ALR(G2-Ad-GFP-h ALR-PA组)后,细胞内的TG及脂滴的红色荧光强度明显下调。2.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-h ALR-NC相比,实验组G2-Ad-GFP-PA中SREBP-1、PPAR-α,ADRP的m RNA及蛋白的表达均显著增加。与G2-Ad-GFP-PA组相比,过表达ALR(G2-Ad-GFP-h ALR-PA组)后,胞内SREBP-1、PPAR-α,ADRP的m RNA及蛋白表达较实验组G2-Ad-GFP-PA下调。3.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-h ALR-NC相比,实验组G2-Ad-GFP-PA中的凋亡率是明显增加的。但与G2-Ad-GFP-PA组比较,过表达ALR(G2-Ad-GFP-h ALR-PA组)后Hep G2细胞的凋亡率明显降低。4.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-h ALR-NC相比,实验组G2-Ad-GFP-PA中的磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相对表达明显增加。但与G2-Ad-GFP-PA组比较,过表达ALR(G2-Ad-GFP-PA)组中磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相对表达明显下调。结论:1.软脂酸能诱导Hep G2细胞的脂肪变性。2.过表达ALR可减轻PA诱导Hep G2细胞的脂滴储积。3.过表达ALR可降低脂肪合成代谢中关键酶(SREBP-1、PPAR-α、ADRP)的表达.4.过表达ALR可减少PA诱导Hep G2细胞的凋亡的发生。5.过表达ALR可抑制MAPK通路中磷酸化蛋白(p-JNK,p-p42/p44,p-p38)的产生。