灿烂弧菌粘附及粘附相关因子功能研究

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锌是细菌中的重要元素,作为蛋白结构组成或多种酶的辅因子辅助催化反应。与Zn2+相关联的蛋白约占细菌总蛋白质的5%,但是过量的Zn2+会对细菌产生毒性,因此细菌中有精确的Zn2+调控系统以维持自身的Zn2+稳态。其中ABC超家族的Zn2+转运系统是细菌主要的Zn2+运输和调控系统,研究证实了它与细菌毒力和粘附功能密切相关。本研究通过序列同源性比对发现灿烂弧菌具有两种ABC型高亲和力Zn2+转运系统ZnuABC和VsABC。通过生物信息学分析,推测出VsABC的周质Zn2+结合蛋白组分VsA具有结合Zn2+功能的结构基础。实时荧光定量检测结果表明,灿烂弧菌VsA基因的表达受到Zn2+调控,添加0.01mM浓度的Zn2+组VsA基因的表达量下调为对照组的0.5倍,而添加0.01mM浓度的Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+对其表达无明显影响。高浓度Zn2+抑制VsA的表达,而低浓度的Zn2+(0.1μM)则会诱导VsA的基因表达量。此外,刺参体腔液组分能诱导灿烂弧菌VsA表达量增加3倍。  另外,利用了抗体封闭方法研究了VsA蛋白在灿烂弧菌生长、抗氧化以及粘附宿主细胞等方面的活性。首先,获得了VsA重组蛋白及其特异的蛋白抗体。封闭灿烂弧菌VsA蛋白能抑制其在Zn2+限制条件下的生长。同时,抗过氧化氢实验的结果表明,VsA抗体处理灿烂弧菌后,菌体抗过氧化氢能力减弱,而用对照抗体处理则没有出现这种情况。在粘附实验中,发现高浓度抗体封闭组(5mg/mL)和低浓度抗体封闭组(1mg/mL)灿烂弧菌粘附数相比于对照组降低了近一半,说明VsA蛋白能影响灿烂弧菌粘附能力,是一种粘附相关因子。本研究发现了灿烂弧菌的第二种ABC型周质Zn2+转运系统VsABC,其周质Zn2+结合组分VsA的基因表达受Zn2+浓度调控,VsA蛋白在灿烂弧菌生长、粘附以及抗氧化功能中发挥一定的作用。
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