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目的:血管新生是由已存在的血管形成新毛细血管的过程,它可以为机体提供更多的血流,但当其发生调节紊乱时可导致多种疾病的病理过程。有研究证实,哺乳动物沉默信息调节因子1(silent information regulator1,SIRT1)在血管新生中起关键调节作用。本实验利用Sirt1转基因(Sirt1-transgenic,Sirt1-Tg)小鼠建立下肢股动脉结扎-缺血模型,对缺血后组织血管新生进行初步研究。方法:1 Sirt1-Tg小鼠饲养、繁殖与仔鼠基因型鉴定随机选取6~8周龄大小的Sirt1-Tg小鼠,按雌雄比例为2:1进行交配,繁殖仔鼠,取仔鼠鼠耳组织提取基因组DNA,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术进行基因型鉴定。2股动脉结扎下肢缺血小鼠模型的复制随机选取8周龄成年雄性野生型(wild-type,WT)C57BL/6小鼠(对照组)及Sirt1-Tg小鼠(实验组)各10只,在固定环境(室温24℃,湿度相对恒定)下,异氟烷麻醉小鼠后,先用血流测量仪(Peri Cam PSI)检测术前各组小鼠双下肢血流灌注情况,采用激光散斑对比分析(Laser Speckle Contrast Analysis,LASCA)技术记录血流图像,用PIMSoft(Software Version 1.5)软件计算左右下肢平均血流的比值。然后在显微镜视野内结扎并剪断左下肢股动脉,手术结束后缝合皮肤,再次观察术后各组小鼠双下肢血流状态并记录血流图像及左右下肢平均血流的比值。3手术后不同时间点检测两组小鼠双下肢血流灌注情况小鼠在麻醉状态下,分别于术后3天、7天、14天,采用Peri Cam PSI对两组小鼠双下肢血流灌注变化情况进行检测,同时记录血流图像及左右下肢平均血流的比值。4免疫组织荧光染色方法检测CD31(cluster of differentiation 31,CD31)的表达情况术后14天对两组小鼠进行血流检测后,麻醉处死小鼠,分别取两组小鼠双下肢腓肠肌,包埋于OCT包埋剂中,并用液氮迅速冷冻后,采用冰冻切片技术进行组织切片,然后切片行组织免疫荧光染色,利用荧光显微镜观察每组小鼠腓肠肌中CD31的阳性荧光强度。5用western blot(蛋白质免疫印迹方法)检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达取术后14天两组小鼠腓肠肌组织进行总蛋白提取,用western blot方法检测组织中VEGF的表达情况。6统计学处理实验重复三次,计量资料以均数±标准差表示,两组间均数比较采用t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1仔鼠基因型鉴定结果对Sirt1-Tg小鼠交配产生的子代小鼠进行基因型鉴定,PCR扩增产物长度为233 bp,琼脂糖凝胶电泳结果显示在250 bp附近可见清晰的条带。2股动脉结扎下肢缺血小鼠模型建造成功用LASCA技术检测血流结果显示,股动脉结扎术前两组小鼠双下肢血流信号分布均匀,WT组小鼠与Sirt1-Tg组小鼠左右下肢平均血流比值分别为0.91±0.07与0.92±0.10(P>0.05);术后,两组小鼠左下肢结扎侧的血流信号均明显减少,甚至消失,WT组小鼠与Sirt1-Tg组小鼠双下肢血流比值分别为0.29±0.05与0.31±0.05(P>0.05),术后与术前相比,差异明显(P<0.01),提示模型建造成功。3 LASCA技术血流检测用LASCA技术检测血流结果显示,股动脉结扎术后3天两组小鼠左下肢结扎侧均显示出微弱的血流信号,WT组小鼠与Sirt1-Tg组小鼠双下肢血流比值分别为0.48±0.05与0.47±0.08(P>0.05),提示血管开始新生;术后7天两组小鼠左下肢血流均逐渐恢复,WT组小鼠与Sirt1-Tg组小鼠双下肢血流比值分别为0.68±0.05与0.55±0.04(P>0.05);术后14天WT组小鼠左下肢血流接近对侧未结扎肢体,而Sirt1-Tg组小鼠左下肢血流信号明显弱于WT组同侧肢体,WT组小鼠与Sirt1-Tg组小鼠双下肢血流比值分别为0.82±0.10与0.66±0.07(P<0.01)。4 CD31免疫组织荧光染色冰冻切片免疫组织荧光染色结果显示,术后14天,与右下肢正常侧相比,两组小鼠左下肢缺血侧腓肠肌组织中CD31荧光表达量均增加,但Sirt1-Tg组小鼠左下肢腓肠肌组织中的CD31荧光密度增加量明显低于WT组小鼠的增加量,WT组小鼠与Sirt1-Tg组小鼠左右下肢腓肠肌的CD31表达量比值分别为1.99±0.17和1.39±0.04(P<0.05)。5腓肠肌组织中VEGF表达量Western blot结果显示,术后14天,与右下肢正常侧相比,两组小鼠左下肢缺血侧腓肠肌组织中VEGF表达量均增加,WT组小鼠与Sirt1-Tg组小鼠左右下肢腓肠肌的VEGF表达量比值分别为2.13±0.52和1.24±0.17(P<0.05),Sirt1-Tg组小鼠左下肢腓肠肌组织中的VEGF增加量明显低于WT组小鼠的增加量,结果与CD31一致。结论:1 Sirt1-Tg小鼠易于繁殖、饲养。2 Sirt1-Tg小鼠缺血部位的血管新生受抑制。3 SIRT1可能是一种内皮细胞增殖抑制因子。