甘蓝型油菜油脂形成转录因子WRI1的克隆与分析

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油菜是世界性主要油料作物,也是我国主要食用油的来源和能源油脂的潜在原料[1]。现植物油脂合成途径已初步阐明,其中相关的关键基因的克隆、鉴定及转基因育种的研究已开展甚多,目前转录因子因存在多样靶基因成为研究热点,其中WRI1主要在油脂合成中对甘油三酯(TAG)积累、种子的碳代谢等方面产生重要作用,高油脂积累与高油酸油菜育种并不冲突,但有关WRI1基因表达调控同油菜油酸含量高低是否存在联系鲜少研究,本文通过核甘蓝型油菜(胞质为野油)湘油15中较高油酸含量小区群体进行研究,试图说明WRI1在油酸含量方面的积极作用,主要结果如下:1.通过RT-PCR方法克隆到3个与NCBI中甘蓝型油菜BnaWRI1基因同源的基因序列,分别命名为BnaWRI1-1A(登录号NM001315608.1,CDS大小1242bp),BnaWRI1-N3(登录号XM013848500.1,CDS大小1230bp),BnaWRI1-N7(登录号HM370542,CDS大小1248bp),以核甘蓝型油菜开花后35天角果的cDNA为模板,获得了三种拷贝的7种基因,其中6类突变基因型,分别命名为BnaWRI1-1、BnaWRI1-2、BnaWRI1-3、BnaWRI1-4、BnaWRI1-5、BnaWRI1-6;1类完全同源的基因型,命名为BnaWRI1-7。通过MEGA5.1软件构建系统进化树发现WRI1基因编码蛋白在不同的物种间的保守性较高,在某些植物中,如拟南芥,存在多拷贝且基因多态性的现象。2.选取4种存在明显突变基因类型的cDNA序列BnaWRI1-2、BnaWRI1-3、BnaWRI1-4、BnaWRI1-6构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转野生型拟南芥,获得转基因拟南芥T1代植株。3.取4个明显突变基因型cDNA序列BnaWRI1-1、BnaWRI1-4、BnaWRI1-5、构建酵母真核表达载体,并在酿酒酵母INVSC 1中表达,对克隆的碱基变异的WRI1基因进行蛋白活性分析。4个基因在酵母表达中不存在明显的蛋白水平差异。4.通过RT-qPCR研究甘蓝型油菜WRI1基因与上游关键基因LEC1、LEC2,油脂合成中的关键基因PDAT-A02、DGAT1、GPAT6在种子发育过程中的时间表达变化,分别取DAF 15、DAF 20、DAF 25、DAF 30、DAF35、DAF 40、DAF 45角果,发现LEC2基因表达量的峰值比LEC1基因出现早,LEC1、LEC2同WRI1基因表达变化的模式基本相同,PDAT-A02在角果发育前期有较高的基因表达,DGAT1、GPAT6较高水平的基因表达发生在角果发育后期。
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