猪细小病毒YK株NS1基因的克隆和序列分析及其地高辛标记核酸探针的研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:coding_key
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猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一,广泛分布于世界各地,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,各国的研究者加强了PPV基因组结构和蛋白质的研究。 NS1蛋白是PPV的主要非结构蛋白,由NS1基因编码。NS1蛋白对PPV早期和晚期的基因转录都发挥着重要的调节作用。本研究以PPVYK株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到NS1全序列基因,将其克隆到pMD18-T质粒载体,获得重组质粒pMD18-T-NS1,并进行序列测定和同源性分析。结果表明,NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中起重要作用的保守基序GKRN,并有3个潜在的糖基化位点NISN、NFSN及NLTR,分别位于356-359、446-449和513-516位氨基酸。PPVYK株NS1基因与其它PPV毒株NADL-2(4973)株、NADL-2(5075)株、NADL-2(5034)株和Kresse株进行比较,核苷酸同源性分别为98.3%、99.9%、99.9%及99.7%,氨基酸同源性分别为99.7%、99.7%、99.7%及97.7%,证实NS1基因具有高度保守性。 根据PPV基因组序列结构,选择了PPVYK株保守序列NS1基因作为探针模板,将NS1基因纯化,利用地高辛标记PPVYK株NS1基因PCR产物和重组质粒pMD18-T-NS1,制备了NS1基因PCR产物探针、克隆NS1探针和线性质粒探针,三种核酸探针的标记效率都达到了0.1pg/μL。特异性试验检测结果表明,这三种探针都能与PPVDNA发生特异的阳性杂交,而与对照病毒PRV、PCV、PRSSV和HCV的核酸杂交呈阴性。敏感性试验检测结果表明,NS1基因PCR产物探针和克隆NS1探针PPVDNA最低检出量为0.5pg/μL,线性质粒探针敏感度为1pg/μL。两种DIG标记的NS1基因PCR产物探针和克隆NS1探针特异性强、敏感性高,可用于PPV的检测。 随着分子生物学的发展,核酸探针以其敏感性和特异性必将成为快速诊断PPV的一种方法。
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