H7N9禽流感病毒感染自从2013年春季爆发以来,已有5波流行病学爆发的报道,导致近1500多例感染报道,死亡人数达500多例,给人们的生命财产带来了严重的威胁。相关研究表明,禽类贸易和活禽市场体系是H7N9禽流感病毒感染持续爆发的主要原因之一。H7N9禽流感病毒为新型重组病毒,其中血凝素HA(Hemagglutinin)来自于家鸭携带的H7N3流感病毒,神经氨酸酶NA(Neuraminidase)来自于野生鸟类携带的H7N9流感病毒,其余重组基因来自于家禽携带的H9N2流感病毒。H7N9禽流感病毒感染人体后,可以导致全身炎症反应,出现呼吸窘迫综合征(ARDS)、休克以及多脏器功能衰竭等严重症状。因此,深入研究并揭示H7N9禽流感病毒导致的临床病毒性并发症的发病机制,对于H7N9禽流感病毒感染的预防、诊断和治疗具有重要意义。宿主天然免疫系统是机体在长期进化过程中形成的可以抵抗病原微生物感染的防御机制,也是机体接收外界病原微生物感染信号以及清除病原体的“第一道防线”。在病毒感染机体时,宿主细胞通过不同的模式受体PRRs(Pattern Recognition Receptors)来识别病原相关分子模式PAMPs(Pathogen-associated Molecular Patterns),进而激活下游一系列的抗病毒固有免疫应答。当流感等RNA病毒进入细胞质以后可以被RIG-I样受体RLRs(RIG-I-like Receptors)所识别,进而激活下游一系列信号通路来促进干扰素以及相应细胞因子的产生。近年来大量研究证实,一些宿主蛋白参与到调控抗病毒感染的固有免疫应答中。因此,通过研究宿主蛋白在固有免疫应答中的作用并探讨其相关作用机制,这对进一步揭示宿主天然免疫系统的抗病毒机制具有重要意义。Musashi家族蛋白是一类RNA结合蛋白,包含Musashi-1和Musashi-2两个成员,且在机体中广泛表达,主要参与基因mRNA转录后水平的调控作用,对维持细胞多种生命活动发挥重要作用。近期有研究发现,Musashi-1蛋白在Zika病毒感染过程中可以和Zika病毒基因组相互作用,从而促进Zika病毒对人体的感染。由于Musashi-1和Musashi-2两者在结构上具有高度同源性,具有约75%氨基酸相似,因此我们推测Musashi-2可能参与到H7N9禽流感病毒感染中。为此,本研究首先探讨了Musahi-2蛋白在H7N9禽流感病毒感染中的表达变化;其次,从分子水平上探讨·Musashi-2与宿主固有免疫应答之间的相互关系及作用机制;最后,本研究继续探讨Musashi-2在H7N9禽流感病毒vRNP复合体转录复制中的作用。在本研究中,我们发现随着H7N9禽流感病毒感染时间或病毒感染滴度的增加,宿主蛋白Musashi-2表达水平也逐渐下降。因此,我们初步推测宿主蛋白Musashi-2参与到H7N9禽流感病毒感染过程中。此外,我们证实,通过Musashi-2 siRNA瞬时转染或慢病毒包装的MSI2 shRNA稳定转染敲减掉内源性Musashi-2蛋白表达可以促进H7N9禽流感病毒感染。相反,通过转染外源性质粒过表达Musashi-2基因,则会抑制H7N9禽流感病毒复制。所以,Musashi-2在H7N9禽流感病毒感染过程中发挥抗病毒感染的作用。基于Musashi-2 shRNA慢病毒系统,我们分别在A549和CaLu-3细胞中敲减掉Musashi-2表达,然后感染H7N9禽流感病毒,发现敲减掉Musashi-2可以抑制H7N9禽流感病毒感染介导的I型干扰素一IFN-β以及细胞炎症因子白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子ct(TNF-α)、调节活化正常T细胞表达和趋化因子(RANTES)、干扰素诱导蛋白10(IP-10)的表达。在揭示Musashi-2调控H7N9禽流感病毒感染介导的炎症反应机制中,我们发现,Musashi-2可以调控转录因子IRF-3和NF-κB磷酸化水平以及核转移水平。本研究通过Western blot研究发现,敲减Musashi-2可以抑制H7N9禽流感病毒感染介导的IRF-3和NF-bkB的磷酸化水平。转录因子IRF-3和NF-κB在H7N9禽流感病毒感染后,可以从细胞浆转移到细胞核中,从而分别激活IFN-β以及炎症因子IL-6、TNF-α、RANTES以及IP-10的释放。因此,本研究进一步通过核质抽提实验发现,敲减Musashi-2表达可以抑制转录因子IRF-3和NF-κB从胞浆转移到细胞核,从而进一步抑制下游分子表达,相反,通过转染pCMV3-MSI2-Myc质粒过表达Musashi-2水平则可以促进IRF-3和NF-κB从胞浆转移到细胞核,从而促进下游分子表达。本研究进一步探讨了 Musashi-2对JAK-STAT通路的作用。结果表明,通过敲减Musashi-2可以抑制STAT1磷酸化水平,也进一步下调抗病毒蛋白ISGs(ISG15、MXA)表达水平。此外,除了研究Musashi-2在宿主固有免疫应答中发挥抑制病毒感染的作用外,本研究还进一步发现Musashi-2可以和H7N9禽流感病毒的NP蛋白产生相互作用,并进一步阻碍NP蛋白和转移蛋白Importin-α(Importin-α 1,Importin-α3,Importin-α5,Importin-α7)之间的结合作用,从而阻止H7N9禽流感病毒基因组vRNP复合体从细胞浆转移到细胞核,最终抑制H7N9禽流感病毒基因组转录复制作用。这些结果表明,Musashi-2蛋白在H7N9禽流感病毒感染中通过调节宿主固有免疫应答以及抑制病毒基因组转录复制而发挥抑制H7N9禽流感病毒感染的作用。本论文研究结果首次揭示了宿主蛋白Musashi-2在H7N9禽流感病毒感染中的作用,并阐述相关机制:1)在H7N9禽流感病毒感染中,Musashi-2促进IRF-3和NF-tkB核转移,从而分别促进IFN-β和IL-6、TNF-α、RANTES、IP-10的表达。2)Musashi-2还参与到H7N9禽流感病毒感染介导的JAK-STAT信号通路激活的调控作用,从而影响抗病毒蛋白ISG15以及MXA的释放。3)Musashi--2抑制H7N9禽流感病毒NP蛋白和Importin-α之间的相互作用,进一步阻碍vRNP从胞浆转移到胞核,从而抑制病毒复制。本研究有助于阐明宿主蛋白Musahsi-2在H7N9禽流感病毒感染中的相关作用及机制,为临床上预防H7N9禽流感病毒感染以及抗病毒药物的研发提供重要理论依据。