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随着越来越多的新基因的发现,基因融合蛋白表达体系以其在新发现蛋白研究中的显著优势已得到广泛应用。该体系具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便,以及利于抗体制备等特点。1988年,Smith和Johnson提出GST融合蛋白表达体系。使用基因融合表达系统在大肠杆菌中可以成功地生产出大量可溶的、能正确折叠、有生物活性的蛋白质,GST融合蛋白可被位点特异性蛋白酶裂解,从而除去GST蛋白。因而这种方法已越来越受到研究者们的欢迎。其中GST融合系统就是经常使用的一种。实验所用载体pGEX将外源基因克隆到强启动子下游,经IPTG诱导表达后,可显著提高融合蛋白的表达产率。谷胱甘肽-S-转移酶( Glutathione-S-transferase,GST)是广泛存在于各种生物体内的由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶,分子量为23-29KDa[1]。GST融合蛋白的分子量更大,是一个非常好的免疫原,因此,很容易制备抗体。正是由于以上的优点,商品化的GST融合蛋白表达体系至今仍被广泛应用。由于该体系表达的融合蛋白必须使用市售的特定的亲和层析系统纯化,如Glutathione-Resin或Glutathione-Sepharose-4B亲和层析柱,Glutathione亲和层析柱存在价格昂贵,使用寿命有限,重复利用效果不佳等缺点。因此,我们以GST融合蛋白为抗原,制备相应的抗GST蛋白的McAb,建立了新的GST亲和层析系统。McAb亲和层析不仅可以替代Glutathione-Resin,还可用于Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。所以利用McAb纯化GST融合蛋白不但特异性好,可重复使用,而且生产成本低,是一种经济、实用的方法,且可用于Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。本研究用含有谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)蛋白基因的pGEX-4T-1质粒转化E.coli BL21,经IPTG诱导后,表达得到GST蛋白,并进行纯化,用纯化的GST蛋白作为抗原,按照单克隆抗体制备程序,获得了3株稳定分泌抗GST McAb的细胞株,命名为:2F5,2G1,3C7。通过对3株杂交瘤细胞株所获得单抗的亚类、腹水ELISA效价、亲和力等进行了鉴定。ELISA分析表明,该单抗能够与GST蛋白、含有GST标签的多种融合蛋白,如GST-PreS1融合蛋白发生特异性的结合。用HRP分别标记三株McAb后,与其余两株分泌的McAb分别用夹心ELISA法进行选择,确定2F5株所产McAb与2G1株所产McAb反应性最好,说明2F5、2G1为所需要的针对GST不同抗原表位的McAb细胞株。使用2F5、2G1进行GST的ELISA检测方法的研究,通过对固相载体、包被时间、封闭液及封闭时间、PBS稀释液NaCl浓度和Tween-20浓度等条件分别进行了比较研究,最后优化组合,初步确立了GST的双抗夹心ELISA检测方法。GST的双抗夹心ELISA检测方法能较好地对GST融合蛋白表达产量进行检测,同时,将单抗和亲和柱耦联,可用于GST融合蛋白的纯化。