[背景和目的]原发性肝癌(Primary liver cancer, PHC)是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一[1]。随着社会经济的快速发展,其发病率有逐年上升的趋势,在我国其死亡率已跃居肿瘤死亡率的第二位,严重地威胁着人类的健康和生命安全[2-4]。原发性肝癌在组织学上可以分为三类：肝细胞型肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)、胆管细胞型肝癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma, IHCC)和混合型肝癌,在我国绝大多数(90%以上)的原发性肝癌都是肝细胞型肝癌[5]。肝细胞型肝癌的病因和发病机制异常复杂,许多生物学行为目前还不清楚[6-7]。手术切除仍是首选的、最有效的治疗方法[8]。虽然近年来在肝细胞型肝癌的早期诊断、早期治疗以及基础研究上取得了显著的进步,但是肝细胞型肝癌的预后仍然较差,即使获得了根治性切除,5年内仍有60%-70%的病人出现转移或复发[9-11]。随着分子生物学技术的发展,以及凝集素在糖链结构检测中的应用,糖生物学与肿瘤学的关系倍受瞩目[12,13]。肿瘤细胞的诸多生物学行为与细胞表面糖基化水平的异常有密切的关系,许多糖链结构甚至被认为是“肿瘤相关碳水化合物抗原(Tumor associated carbohydrate antigens, TACA),并且认为与肿瘤细胞的发生、增殖、转移和免疫逃避等有着密切的关系。例如,在人乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤中可以检测到N-连接糖链β1,6N-乙酰葡糖胺(β1,6G1cNAc)的含量异常升高[17-19]；LewisX抗原是一种糖类相关性抗原,可以特异性的识别并结合选择素E(一种表达于血管内皮细胞上的粘附分子),从而介导肿瘤细胞的血行转移[20-21]。岩藻糖(Fucose)是广泛地参与各种糖链结构的合成,是糖链合成过程中的终末残基之一[22-24]。真核细胞表面的糖蛋白或者糖脂中都含有岩藻糖基化的糖链,许多研究表明岩藻糖残基与细胞的识别、黏附、迁移和生长等有关[25,26]。肿瘤发生、发展的过程中常伴有岩藻糖基化的异常,这种异常可能不仅仅是肿瘤细胞代谢的结果(或标志物),其本身可能还参与肿瘤细胞的生长、浸润和转移等多种生物学行为,例如,在伴有转移的前列腺癌患者的血清及尿液中岩藻糖基化的前列腺特异抗原(Prostatic specific antigen, PSA)要明显高于未发生转移的前列腺癌患者[27]；再如,在肺癌患者中,如果岩藻糖基转移酶的活性升高,往往提示病人的预后较差,肿瘤发生转移的可能性大[28,29]。在肝细胞型肝癌患者的血清中,岩藻糖苷酶和岩藻糖基转移酶的活性往往都升高[30,31]。岩藻糖苷酶是一种水解酶,广泛的分布于人体各种组织细胞的溶酶体和体液中,其主要的生理功能是参与含岩藻基的糖链的分解代谢,临床上我们可以观察到,肝细胞型肝癌患者血清中岩藻糖苷酶的活性异常升高,并已将其作为诊断肝细胞型肝癌的标志物之一；而岩藻糖基转移酶的功能则正好相反,主要参与含岩藻基的糖链的合成代谢。细胞内的岩藻糖基化水平主要取决于岩藻糖苷酶和岩藻糖基转移酶的平衡及其活性的高低。那么作为岩藻糖苷酶和岩藻糖基转移酶的重要底物-岩藻糖,有无变化以及有何变化目前还不清楚。而且,目前国内外关于肝细胞癌发生过程中岩藻糖基化修饰代谢的研究都集中在血清和肿瘤组织的总体水平上,而与肝癌细胞诸多生物学行为直接相关的细胞表面的岩藻糖的变化却未见报道。因此,我们设计了本实验,拟通过流式细胞仪测定正常人肝细胞株、低转移潜能人肝癌细胞株和高转移潜能人肝癌细胞株表面岩藻糖含量的差异,来了解肝细胞型肝癌发生过程中细胞表面岩藻糖含量的变化,以及这种变化与癌变后细胞的转移潜能之间的关系。[材料和方法]1.研究对象正常人肝细胞株(L-02)、低转移潜能人肝癌细胞株(MHCC97-L)以及高转移潜能人肝癌细胞株(HCCLM3),以上三株细胞均购于中南大学湘雅中心实验室。将5×106个肝癌细胞接种至裸鼠的皮下,MHCC97-L和MHCCLM3肝癌细胞株的致瘤率均为100%；肝脏原位接种后,MHCC97-L细胞株的腹壁转移率为20%,肝内转移率为0,膈肌转移率为0,肺转移率为40%；肝脏原位接种后,MHCCLM3的腹壁转移率为100%,肝内转移率为100%,膈肌转移率为70%,肺转移率为1000%[32,33]。2.细胞的扩增正常人肝细胞株、低转移潜能人肝癌细胞株和高转移潜能人肝癌细胞株,均用含有15%特级胎牛血清的高糖DMEM培养基,于37℃、5%C02及95%湿度的培养箱中静置培养,达到融合生长时,用0.25%的胰蛋白酶消化传代,每株细胞分成7份,分别接种于不同的培养皿中(共3×7=21份)。而后继续用含有15%特级胎牛血清的高糖DMEM培养基,在37℃、5%CO2及95%湿度的培养箱中静置培养,当细胞再次达到融合生长时,用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,PBS液洗涤3次,再用PBS液重悬细胞,将细胞浓度均调整为1×106／ml。3.实验分组取上述的细胞悬液各500μl,分别加入不同的离心管中,共21管,为样本管。在装有正常人肝细胞(L-02)的7个离心管上依次标明N1-N7,为正常肝细胞组；在装有低转移潜能人肝癌细胞(MHCC97-L)的7个离心管上依次标明L1--L7,为低转移潜能肝癌细胞组；在装有高转移潜能人肝癌细胞(HCCLM3)的7个离心管上依次标明H1-H7,为高转移潜能肝癌细胞组。再用相同的方法取细胞悬液各500μl,分别加入不同的离心管中,在装有正常人肝细胞(L-02)的7个离心管上依次标明CN1-CN7,在装有低转移潜能人肝癌细胞(MHCC97-L)的7个离心管上依次标明CL1一CL7,在装有高转移潜能人肝癌细胞(HCCLM3)的7个离心管上依次标明CH1-CH7,共21管,为流式细胞仪检测过程中样本管的对照管。4.岩藻糖含量的检测本实验的主要原理是利用荧光标记的荆豆凝聚素(FITC-UEA)能与岩藻糖特异性结合。在暗室内,向样本管(共21管)中加入10μg荧光标记的荆豆凝聚素和PBS液至1000μl；向对照管(共21管)中加入500μl的PBS液至1000μl。样本管和对照管均充分混匀后,立即放置于4℃的环境中,避光孵育1小时。1小时后,取出离心管,用PBS液洗涤细胞2次(800rpm,离心3分钟),而后加入300μl1%的多聚甲醛溶液固定,再进行荧光显微镜检查和流式细胞仪检测。5.观察指标5.1荧光显微镜下观察细胞荧光染色的部位和亮度分别取适量的上述细胞悬液进行细胞涂片,并立即在荧光显微镜下观察三株细胞荧光染色的部位和荧光的亮度。荧光染色的部位表示岩藻糖所在的位置；在相同的曝光时间下,荧光的亮度可以定性地反映岩藻糖含量的高低。5.2流式细胞仪检测细胞表面的平均荧光强度分别取上述细胞悬液200μl(至少含有106个细胞),立即上机进行流式细胞仪检测,测定三株细胞表面的平均荧光强度。细胞表面的平均荧光强度可以定量的反映三株细胞表面岩藻糖含量的多少。6.统计学分析所有数据均用均数±标准差(χ±S)表示,应用SPSS13.0统计分析软件进行统计学处理。假设检验水准α=0.05,采用双侧检验。多组均数方差齐性,比较正常人肝细胞株、低转移潜能人肝癌细胞株以及高转移潜能人肝癌细胞株三组细胞表面的平均荧光强度采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；比较正常人肝细胞株与低转移潜能人肝癌细胞株,正常人肝细胞株与高转移潜能人肝癌细胞株,低转移潜能人肝癌细胞株与高转移潜能人肝癌细胞株表面的平均荧光强度,采用LSD法(least-significant difference,最小显著差异t检验)。[结果]1.荧光显微镜下观察到的结果在相同的曝光时间下,我们观察到正常人肝细胞株、低转移潜能人肝癌细胞株以及高转移潜能人肝癌细胞株的细胞膜均被染成深绿色,但相应的细胞浆和细胞核则呈弱染色或者未见染色,高转移潜能人肝癌细胞株表面的荧光亮度显著强于低转移潜能人肝癌细胞株和正常人肝细胞株,低转移潜能人肝癌细胞株表面的荧光亮度又高于正常人肝细胞株。即在正常人肝细胞株、低转移潜能人肝癌细胞株以及高转移潜能人肝癌细胞株的细胞表面岩藻糖含量逐渐增多。2.流式细胞仪检测的结果正常人肝细胞株、低转移潜能人肝癌细胞株和高转移潜能人肝癌细胞株表面均可以检测到一定数量的荧光强度,其平均荧光强度分别为(11139.29±496.88)、(14161.14±960.11)和(19081.43±665.39)。即高转移潜能人肝癌细胞株表面的岩藻糖含量显著高于低转移潜能人肝癌细胞株和正常人肝细胞株,分别为1.35倍和1.71倍；低转移潜能人肝癌细胞株表面的岩藻糖含量又高于正常人肝细胞株,约1.27倍。[结论]肝细胞表面的岩藻糖含量变化与肝细胞癌变以及癌变后的转移潜能有关。肝细胞癌变后,其细胞表面的岩藻糖含量增加,并且肝癌细胞的转移潜能越高,其表面的岩藻糖含量也越高。