家蚕生长发育调控网络中若干基因的克隆和分析

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昆虫的蜕皮和变态是由保幼激素和蜕皮激素进行调控的。同时,蜕皮激素对昆虫的生长,发育和繁殖等都具有重要作用。昆虫体内蜕皮激素的生理平衡主要是依靠其生物合成和降解。在大多数昆虫的幼虫阶段,前胸腺是蜕皮激素的主要来源,其主要成分是ecdysone。在多数的鳞翅目昆虫中,前胸腺的主要产物是3-dehydroecdysone(3DE),伴随着比率不断变化的ecdysone。   昆虫体内蜕皮激素水平的降低主要是由于蜕皮激素的灭活和排泄造成的。蜕皮激素的灭活主要有三种途径:(1)26-hydroxylation后再进一步氧化形成26-oic acid,(2)形成不同种类的共轭化合物(如:磷酸盐),(3)鳞翅目昆虫中,在ecdysone oxidase的催化下形成3-dehydroecdysteroid,随后再被还原成3-epiecdysteroid,最后在磷酸转移酶催化下形成磷酸盐共轭化合物。在最后一个途径中,主要有3个酶参与了该反应,分别是ecdysone oxidase,3DE3α-reductase和3DE3β-reductase。   Ecdysone oxidase是蜕皮激素灭活途径中一个关键的酶。本研究中,我们克隆并鉴定了家蚕ecdysone oxidase(BmEO)基因。BmEO基因的cDNA包含一个1695 bp的ORF,编码564个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为62 kDa,等电点为4.6,属于Glucose-methanol-choline oxidoreductase superfamily。分别在N-terminal和C-terminal包含有一个Glucose-methanol-choline oxidoreductase的功能域。用RT-PCR和Quantitativereal-time PCR的方法比较了BmEO基因在家蚕各组织中的表达水平发现该基因主要是在血液中表达。家蚕幼虫发育过程中BmEO的表达水平变化与幼虫体内蜕皮激素的滴度变化相对应。给家蚕幼虫添食蜕皮激素可以诱导其表达。对BmEO的RNAi可以使其表达量下降,减少这个酶可能会引起蜕皮激素滴度的增加。表型观察结果显示可以导致实验组的幼虫和蛹的死亡,并且表型与注射蜕皮激素的对照相似。可见该基因在昆虫变态发育中的重要作用。   3DE3α-reductase是该途径中另一个关键的酶。我们克隆并鉴定了家蚕3DE3α-reductase基因。3DE3α-reductase基因的cDNA包含一个783 bp的ORF,编码260个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为28 kDa,等电点为7.8。该基因属于short-chaindehydrogenases/reductases superfamily,并且有一个NAD(P)-binding domain,推测其功能需要NADPH的存在。用RT-PCR-和Quantitative real-time PCR的方法比较了3DE3α-reductase基因在家蚕各组织中的表达水平发现该基因主要是在中肠和血液中表达。家蚕幼虫发育过程中3DE3α-reductase的表达水平变化与幼虫体内蜕皮激素的滴度变化相对应,该结果与BmEO的变化相似。   3DE3β-reduerase也是该途径中一个关键的酶。我们克隆并鉴定了家蚕3DE3β-reductase基因。3DE3β-reductase基因的cDNA包含一个972 bp的ORF,编码323个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为39kDa,等电点为5.5。该基因属于aldo-ketoreductase(AKR)superfamily,该基因也有一个NAD(P)-binding domain,推测其功能也需要NADPH的存在。这点和3DE3α-reductase十分相似。用RT-PCR和Quantitative real-timePCR的方法比较了3DE3β-reductase基因在家蚕各组织中的表达水平发现该基因主要是在生殖器和脂肪体中表达。家蚕幼虫发育过程中3DE3β-reductase的表达水平变化与幼虫体内蜕皮激素的滴度变化是一个相反的情况,由于其反应是一个逆反应,因此该结果与BmEO和3DE3α-reductase的变化相反。   JH的生理平衡取决于其合成和降解代谢。JH酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE),JH环氧化物酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)和JH二醇激酶(Juvenilehormone diol kinase,JHDK)是昆虫中JH降解代谢的3个关键酶。我们的试验结果表明,在JHE高表达的地方,JHEH同样也是高表达的。这一结果显示JH的降解过程中JHE和JHEH可能同时发挥作用。但是JHDK只是在中肠中高表达,我们推测JHEH和JHE将JH水解成JHd,然后JHd又被运送到中肠被JHDK进一步水解,最终排出体外。这些结果表明,JH在不同时期和不同组织其降解代谢也有所不同,这与JH所发挥的功能相对应。
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