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目的:1、探讨腺病毒介导热休克蛋白70(HSP70)基因转染液的制备。2、探讨腺病毒介导HSP70基因转染到新生大鼠肺组织内最佳转染途径、转染量和转染时间。3、探讨通过基因转染技术,观察经HSP70基因转染后缺氧性肺动脉高压(HPH)新生大鼠的肺动脉压力、肺血管结构及重塑指标改变的情况,以及肺组织中HSP70、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及其下游靶基因内皮素-1(ET-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况,了解HSP70对HPH新生大鼠肺动脉压力、肺血管重塑的作用,进一步推断HSP70能否通过下调HIF-1α及其下游靶基因的表达,进而延缓新生大鼠HPH的发生发展,为临床防治该病提供理论依据。方法:1、通过pHBAd-MCMV-GFP-HSP70质粒的构建,利用双质粒共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒,进行毒种的鉴定、生产、纯化及滴度测定。2、(1)将48只新生大鼠随机分为A:尾静脉注射组,B:腹腔注射组,将5ul×1010 PFU/ml腺病毒HSP70(Ad-HSP70)转染液注入新生大鼠体内,分别在观察时间点将各组新生大鼠处死,留取肺组织标本,用荧光显微镜判断HSP70转染到新生大鼠肺组织的途径。(2)将54只新生大鼠随机分为:空病毒组,病毒HSP70组,对照组,分别给予2.5ul×1010PFU/ml、5ul×1010 PFU/ml、10ul×1010 PFU/ml的转染液剂量,经过尾静脉注射转染后72h将各组新生大鼠处死,留取肺组织标本,用RT-PCR及Western blot检测HSP70的mRNA及蛋白质水平,确定腺病毒介导的HSP70转染的最佳转染量。(3)确定腺病毒介导HSP70转染的最佳途径、最佳转染量后,按照不同转染时间将48只新生大鼠随机分为24h组,48h组,72h组,96h组,同时设立盐水空白对照组,按照时间点处死新生大鼠,留取肺组织标本,采用RT-PCR及Western blot检测HSP70的mRNA及蛋白质水平,明确HSP70在新生大鼠肺组织内表达的最佳转染时间。3、将128只新生大鼠随机分为2组:HPH组(H)和空白对照组(C)。H组:根据转染液不同再分为H1:盐水组、H2:空病毒组(pHBAd-MCMV-GFP)、H3:病毒HSP70组(pHBAd-MCMV-GFP-HSP70)。H组新生大鼠注射病毒转染液或无菌盐水后立即建立HPH模型,并分别于缺氧3d、7d、10d、14d和对照组同步进行观察。(1)在不同观察时间点测定肺动脉压力(mPAP),比较各组mPAP的变化情况,了解腺病毒介导的hsp70是否有降低mpap的作用。(2)用光学显微镜、电子显微镜分别观察肺小动脉组织结构及肺血管超微结构变化,测定肺小血管重塑指标(mt%、ma%)。(3)用免疫组化、rt-pcr和westernblot法分别检测不同时间点各组新生大鼠肺组织中hsp70、hif-1α、et-1、inos的mrna及蛋白质的表达情况,比较四种因子在各组之间的差异,从而进一步推断腺病毒介导的hsp70阻断hif-1α及其靶基因在新生大鼠hph中的作用。结果:1、重组质粒phbad-mcmv-gfp-hsp70序列测定与genebank的登记序列一致,确定为hsp70基因。2、(1)尾静脉注射组新生大鼠48小时荧光显微镜下见少量绿色荧光信号标记蛋白,72及96小时见明显的绿色荧光信号标记蛋白。(2)5ul×1010pfu/mlad-hsp70转染剂量的新生大鼠肺组织内hsp70mrna及蛋白质表达量增高。(3)转染新生大鼠72h后,新生大鼠肺组织内hsp70mrna及蛋白质表达量较24h、48h增高(p<0.05),与96h比较差异无统计学意义(p>0.05)。3、(1)h1组与h2组缺氧3d、7d、10d、14d的mpap水平与对照组比较显著增高,差异有统计学意义(p<0.05);h3组缺氧3d、7d、10d的mpap水平与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05),缺氧14d的mpap水平与同日龄h1及h2组比较差异无统计学意义(p>0.05)。(2)he、vg染色光镜下观察h3组缺氧3d、7d、10d无肺血管重塑,14d肺血管重塑较轻;电镜下肺超微结构显示h3组缺氧7d、10d、14d肺血管重塑减轻;缺氧7d、10d各组间肺血管ma%、mt%比较差异有统计学意义(p<0.05),c组及h3组与h1、h2组比较差异有统计学意义(p<0.05);缺氧14d各组间肺血管ma%、mt%比较差异有统计学意义(p<0.01),c组与hph各组间比较差异有统计学意义(p<0.01)。(3)免疫组化显示对照组肺组织中hsp70、hif-1α、et-1及inos免疫反应强度呈阴性,hph各组hsp70、hif-1α、et-1及inos免疫反应强度呈不同程度的阳性反应,其表达多见于肺血管壁内皮细胞质与细胞上;缺氧3d、7d、10d各组间hsp70免疫组化表达强度比较差异有统计学意义(p<0.05),hph各组与c组比较表达增强差异有统计学意义(p<0.01),h3组与h1、h2组比较表达增强差异有统计学意义(p<0.01);缺氧3d、7d、10d各组间hif-1α、et-1及inos的免疫组化表达强度比较差异有统计学意义(p<0.01),hph各组均表达增强,h3与h1、h2组比较表达降低,差异有统计学意义(p<0.01)。(4)缺氧3d、7d、10dhsp70的mrna表达各组间比较差异有统计学意义(p<0.01),hph各组与c组比较表达增强差异有统计学意义(p<0.05),h3组与h1、h2组比较表达增强差异有统计学意义(p<0.05),14dhph组与c组比较差异有统计学意义(p<0.05);缺氧3d、7d、10d各组间hsp70蛋白质表达比较差异有统计学意义(p<0.05),h1、h2组与c组比较表达增强差异有统计学意义(p<0.01),h3组与h1、h2组比较表达增强差异有统计学意义(p<0.05)。(5)缺氧3d、7d、10dhif-1αmrna、et-1mrna、iNOSmRNA表达各组间比较差异有统计学意义(P<0.01),H1、H2组与C组比较表达增强差异有统计学意义(P<0.05),H3组与H1、H2组比较表达降低差异有统计学意义(P<0.05);各组间HIF-1α、ET-1、iNOS的蛋白质比较差异有统计学意义(P<0.05),H3组与H1、H2组比较表达降低差异有统计学意义(P<0.05)。缺氧14d各组间iNOSmRNA表达比较差异有统计学意义(P<0.05),HPH各组与C组比较表达增强差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1、成功构建了HSP70基因重组腺病毒载体及制备高滴度的重组腺病毒。2、确定腺病毒介导的HSP70在新生大鼠体内转染的最佳途径:尾静脉,转染量:5ul×1010PFU/ml及转染后最早观察时间点:72 h。3、缺氧应激可以引起内源性HSP70表达,腺病毒介导的HSP70可以提高HPH新生大鼠肺组织外源性HSP70的表达,下调HIF-1α、ET-1、iNOS的表达,降低肺动脉压力,减轻肺血管重塑,可以成为治疗新生儿HPH的一种新策略。