内皮微颗粒与血管内皮细胞损伤相关性的实验研究

来源 :苏州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huihuishou4001
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第一部分肿瘤坏死因子-α[促进CD62E+、CD31+内皮微颗粒的释放及其机制   目的:采用不同浓度的肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)体外刺激人脐静脉内皮细胞,观察INF-α所致内皮细胞损伤及其培养上清中CD62E+、CD31+内皮微颗粒释放水平,并初步探讨内皮细胞内的活性氧(Reactive oxygenspecies,ROS)在内皮微颗粒形成中的可能机制。   方法:倒置光学显微镜和共聚焦荧光显微镜下观察不同浓度INF-α作用于内皮细胞24h后,细胞形态和核的改变;流式细胞仪检测培养上清中CD62E+、CD31+EMPs的释放水平;荧光探针DCFH-DA法检测内皮细胞内活性氧的生成情况。   结果:TNF-α可致内皮细胞形态和细胞核改变;随着TNF-α刺激浓度的增加,其培养上清中,CD62E+EMPs释放水平越明显,与对照组相比,差异具有显著性(P<0.01);上清中CD31+EMPs释放水平也明显增高,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);与对照组相比,CD62E+/CD31+EMPs二者比值明显增大(P<0.01);随着TNF-α刺激浓度的增加,细胞内活性氧的水平升高越明显,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。   结论:不同浓度的TNF-α致损内皮细胞的程度不同,随着TNF-α刺激浓度的增加,内皮细胞的损伤程度更明显,CD62E+EMPs和CD31+EMPs释放量也相应增加,尤以CD62E+EMPs增加为甚,推测CD62E+EMPs释放水平可用来预测内皮损伤程度;推测ROS途径可能参与了内皮微颗粒形成与释放的过程。   第二部分外源性CD62E+内皮微颗粒对内皮细胞生长的影响   目的:观察外源性CD62E+EMPs对人脐静脉内皮细胞增殖活性、细胞生长周期及凋亡的影响,探讨CD62E+EMPs与内皮细胞损伤程度的相关性。   方法:扫描电镜下观察人脐静脉内皮细胞膜表面微颗粒释放情况;CD62E+EMPs的检测:以100ng/ml TNF-α[刺激呈单层细胞生长的人脐静脉内皮细胞24h,收集细胞培养上清,离心并去除细胞碎片,再收集细胞培养上清,以20500g超速,4℃离心2h,弃上清液,用含2%FBS的培养液悬浮微颗粒,流式细胞仪检测悬液中CD62E+EMPs的浓度,并于2h内用于实验;CCK-8法检测外源性CD62E+EMPs对内皮细胞增殖活性的影响;FCM PI单染法检测外源性CD62E+EMPs对内皮细胞生长周期的影响;PI/Annexin V+双染法检测外源性CD62E+EMPs对内皮细胞凋亡的影响。   结果:经扫描电镜观察TNF-α[所刺激的人脐静脉内皮细胞,可见膜表面分泌的直径约1.0μm小囊泡,证实了膜表面内皮微颗粒的释放;流式细胞仪检测到经超速离心后收集的悬液中CD62E+EMPs的浓度约为4x107/ml;经105/ml、106/ml、107/mlCD62E+EMPs作用内皮细胞24h后,可明显抑制内皮细胞增殖,细胞增殖抑制率分别为19.1±2.2%、34.2±3.7%和45.7±4.2%,105/ml、106/ml、107/ml浓度组与104/ml浓度组相比,差异有统计学意义(P<0.05);经104/ml、105/ml、106/ml、107/mlCD62E+EMPs刺激内皮细胞24h后,G0/G1期比例分别为50±2.8%、59.8±2.3%、66.1±2.2%和73.3±3.1%,105/ml、106/ml、107/ml浓度组与104/ml浓度组和正常细胞对照组(48士3%)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。PI/AnnexinV+双染法FCM证实104/ml、105/ml、106/ml、107/ml CD62E+EMPs诱导内皮细胞24h后,可促进内皮细胞发生凋亡效应,其凋亡率分别为3±0.6%、6.32±1.2%、9.2±1.3%和11.4±1.2%,105/ml、106/ml、107/ml浓度组与104/ml浓度组和对照组(1.5±0.5%)相比,差异有统计学意义(P<0.05)。   结论:外源性CD62E+EMPs可抑制内皮细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期,同时诱导内皮细胞发生凋亡效应,对内皮细胞具有直接损伤作用。   第三部分辛伐他汀对内皮细胞微颗粒释放的影响及其机制的研究   目的:研究辛伐他汀对TNF-α诱导的内皮细胞微颗粒释放的影响及其机制,探讨在内皮保护剂作用下,内皮细胞释放内皮微颗粒的情况。   方法:用10ng/mlTNF-α作用于内皮细胞,经不同浓度的辛伐他汀保护剂作用后,在倒置光学显微镜下观察内皮细胞形态学改变,在共聚焦荧光显微镜下观察Hochest单染的内皮细胞核的形态学变化;用流式细胞技术检测细胞培养上清中CD62E+、CD31+EMPs的释放水平;用荧光探针DCFH-DA法检测内皮细胞内活性氧的生成情况;   结果:10ng/ml TNF-α刺激内皮细胞后,可引起细胞形态拉长及细胞间隙增大以及细胞核的形态学改变,经0.1、1、5μmol/L辛伐他汀干预后,未见细胞形态改变;其细胞培养上清中CD62E+EMPs释放量水平分别为1.654±0.18、1.25±0.09、1.02±0.2x106/ml,能明显抑制CD62E+EMPs的释放,与未经辛伐他汀保护的单纯TNF-α处理组(2.56±0.16×106/ml)相比,有显著性差异(P<0.01)。经0.1、1、5μmol/L辛伐他汀干预后,内皮细胞释放的CD31+EMPs的量分别为20.64±219.44±1.418.84±2×103/ml,与未经辛伐他汀保护的单纯FNF-α处理组(21.1±2.5×103/m1)相比,差异无统计学意义(P>0.05);经0.1、1、51μmol/L辛伐他汀干预后,细胞内活性氧水平分别为对照组的151±12%、1224±10%、1084±10%,与未经辛伐他汀保护的单纯TNF-α处理组(2054±21%)相比,有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05)。   结论:内皮保护剂辛伐他汀可以显著降低TNF-a诱导内皮细胞释放CD62E+EMPs量及抑制细胞内活性氧水平的升高,而对内皮细胞释放CD31+EMPs的抑制作用不明显,推断辛伐他汀可能通过阻断或抑制ROS途径来减少CD62E+EMPs的释放。
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