递送siRNA阳离子脂质体的制备及其体内外的研究

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siRNA能诱导同源序列的信使RNA降解,使相关基因无法表达而抑制恶性肿瘤的发生发展。TAZ基因对多种肿瘤的发生及发展起着促进作用,因此通过siRNA干扰TAZ基因对肝癌细胞的影响值得探究。阳离子脂质体是目前研究广泛的递送siRNA的载体。  本文旨在制备毒性低、转染效率高的阳离子脂质体,为siRNA体外和体内的递送提供有效的载体。探讨运用siRNA沉默TAZ基因对人肝癌细胞HepG2增殖、侵袭和转移的影响。从而找寻针对肝癌细胞治疗的新靶点,为发展肝癌基因治疗奠定理论和实验基础。  第一部分主要构建递送siRNA的阳离子脂质体,并对其理化性质进行表征。运用薄膜分散超声法制备脂质体,超声功率为30%,超声时间为24 min;脂质体的处方为DOTAP∶ DOPE∶ HSPC∶ Chol∶ DSPE-PEG2000-Mal=10∶10∶33∶23.5∶2.5,脂质体/siRNA复合物粒径为164.63 nm,Zeta电位为+18.90 mV,结合率为93.00%;透射电镜下脂质体/siRNA复合物为均匀的类球状结构;脂质体/siRNA复合物在1%至5%(w/v)氯化钠溶液中稳定。  第二部分主要对脂质体的体外毒性、转染效率及摄取机制进行初步体外水平的研究。脂质体的毒性小于市售转染试剂XsTR(P<0.05);共聚焦显微镜显示转染4h后即有大量siRNA进入细胞质内;脂质体与XsTR相比转染能力相当,并且血清并不影响其转染效果;脂质体可能主要是通过非能量依赖的膜融合途径进入细胞。  第三部分主要阐述用siRNA沉默TAZ基因对肝癌细胞增殖、侵袭和转移的影响。脂质体与市售转染试剂的基因沉默效果并无显著差异(P>0.05);在HepG2细胞中,转染TAZ-siRNA后,TAZ的蛋白表达水平降低(P<0.05),第五天及第七天细胞增殖能力较对照组降低(P<0.05),细胞迁移能力和侵袭能力较对照组降低(P<0.05)。  第四部分主要阐述脂质体/siRNA复合物在裸鼠原位肝癌模型的分布。构建裸鼠原位肝癌模型;与裸siRNA相比,脂质体/siRNA复合物在体内滞留的时间更长;裸siRNA通过肾脏快速排出,而脂质体递送的siRNA分布于肾脏、肝脏与肿瘤中。  本研究制备的脂质体能有效递送siRNA至肝癌细胞中,并且能使siRNA发挥良好的基因沉默效果,为进一步的体内外实验研究奠定基础。Hippo通路中转录共刺激因子TAZ对肝癌细胞的增殖、侵袭和转移起到重要作用,希望能为未来的肝癌基因治疗提供新靶点。
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