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背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的神经退行性病变类型,具有发病率高、危害大的特点,目前尚无有效治疗或预防的方法。小胶质细胞是在中枢神经系统中发挥免疫功能的细胞,在引发AD中起关键作用,被认为是淀粉样蛋白沉积、神经纤维缠结之外的第三病理特征。在Aβ斑块的刺激下,小胶质细胞特异性激活NLRP3炎症小体介导的慢性神经炎症参与了 AD的发病机制。AD的症状在中医里可归属“呆证”、“善忘”、“文痴”等病症的范畴,其病机以脏腑虚衰为本,痰瘀致病为标。肾精亏虚,脑髓失充是其发病的主要原因。本课题组前期研究发现艾灸可改善脑内氧化应激状态,下调细胞凋亡通路,延缓衰老,且艾灸已被证明可以调节免疫系统表现出良好的抗炎效果,这提示艾灸可能对AD脑内神经炎症也具有调控作用。因此,基于前期研究提出假说:艾灸可通过影响NLRP3炎症小体介导的小胶质细胞极化以调控阿尔茨海默病脑组织神经炎症反应,从而起到抗神经炎症抗AD的作用。目的观察艾灸干预对AD模型小鼠学习记忆能力、淀粉样蛋白沉积、小胶质细胞极化表现以及NLRP3炎症小体的影响,从神经炎症角度探讨艾灸防治AD的作用机制。方法24只6月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组和艾灸组,将12只野生型C57BL/6小鼠作为空白组。模型组和空白组小鼠:每天抓取,固定于小鼠固定器中,暴露于室内空气中;艾灸组小鼠每日抓取固定于小鼠固定器中,使用艾条对准小鼠关元穴处施灸。所有干预均为每日20 min,1周6次,共计8周。于第9周开始进行Morris水迷宫实验、Y迷宫实验、高架十字迷宫实验和旷场实验。在行为学实验结束后,经深度麻醉后,处死小鼠取出大脑皮层、海马组织,采用刚果红染色法检测海马淀粉样蛋白沉积斑块;免疫荧光双标法检测小胶质细胞表面蛋白CD11b、细胞极化标志物iNOS和Arg-1;使用实时荧光定量PCR检测小胶质细胞M1型和M2型的标志物iNOS、IL-1β、Arg-1、CD206转录表达;使用免疫组织化学、Western blot技术观察各组小鼠海马NLRP3炎症小体上下游通路相关蛋白TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、c-fos的相对表达情况。此外,设置24只6月龄APP/PS1小鼠随机分为艾烟组和香烟组,每日抓取固定小鼠,使用5～15mg/m3浓度的艾烟或香烟烟雾干预20min,1周6次,共计8周;使用刚果红染色、Western blot、免疫组化、ELISA等检测方法,对比艾烟和香烟干预对APP/PS1模型小鼠海马NLRP3炎症小体及血清TNF-α等炎症因子的影响。结果1.各组小鼠行为学实验结果:Morris水迷宫实验:模型组小鼠相比于同龄空白组小鼠记忆能力大幅下降,空间探索实验中表现为活动轨迹杂乱,缺少有目的性的在目标象限和平台所在区域探索,在平台区域游泳的路程和时间均显著低于其他2组小鼠表现（P<0.05）;与模型组相比,艾灸组小鼠逃避潜伏期、穿越平台区域次数、平台区域游泳时间等表现均显著优于模型组小鼠（P<0.05）。Y迷宫实验:小鼠连续进入3条臂的次数和自发交替率从高到低排序依次为空白组>艾灸组>模型组,空白组和艾灸组与模型组相比均有显著性差异（P<0.05）。热图显示空白组小鼠在3条臂探索时间较为均衡,艾灸组小鼠停留在开放臂时间较多,而模型组则在3臂交汇中间区域和新异臂探索时间较多。高架十字迷宫实验:模型组小鼠表现出了明显的焦虑情绪,其探索开放臂的次数和时间均与空白组相比显著减少（P<0.05）,在开放臂中的活动速度却比其他2组高（P<0.05）。艾灸组小鼠在本实验中表现优于模型组,活动轨迹和热图显示,空白组和艾灸组的小鼠仍有较多探索开放臂的活动,而模型组小鼠更倾向于在闭合臂内活动,较少活动至开放臂进行探索,通过开放臂时速度加快。旷场实验:模型组小鼠总活动距离最多（P<0.05）,穿越中央区次数和在中央区停留的时间均比其他2组低（P<0.05）,从活动轨迹和行动热图来看,空白组和艾灸组小鼠活动范围遍布观察箱,模型组小鼠活动量偏多,活动范围多在箱壁和角落附近,较少活动至中央区探索。2.各组小鼠刚果红染色、小胶质细胞极化结果:刚果红染色结果:模型组小鼠海马组织出现较多染成橘红色的Aβ沉淀颗粒,细胞排列散乱不规则,可见较多空隙,细胞凋亡坏死较严重。而艾灸组小鼠病理较模型组减轻,海马组织可见散在Aβ沉积颗粒,细胞排列较整齐,偶见神经元缺失造成的空隙。空白组小鼠海马组织中细胞轮廓清晰,形态正常,细胞排列整齐,有较少的橘红色Aβ沉淀颗粒。小胶质细胞极化结果:①使用激光共聚焦显微镜观察各组小鼠CD11b与iNOS、Arg-1免疫荧光的表达情况,与空白组相比,模型组iNOS表达量增多;与模型组相比,艾灸组iNOS荧光表达降低。与空白组相比,模型组Arg-1荧光表达有所增加;艾灸组与其余2组相比,Arg-1荧光表达显著增加。②实时荧光定量PCR结果显示,与空白组相比,模型组小鼠iNOS和IL-1β的mRNA相对表达量增多（P<0.05）;与模型组相比,艾灸组iNOS和IL-1β显著降低（P<0.05）;与空白组相比,模型组小鼠Arg-1的mRNA含量显著增多（P<0.05）,与模型组相比,艾灸组Arg-1的mRNA表达显著增高;与空白组相比,艾灸组小鼠CD206的mRNA含量显著增多（P<0.05）。3.各组小鼠NLRP3炎症小体相关蛋白表达情况:Westernblot结果:各组小鼠海马NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达进行比较,由高到低依次是模型组>艾灸组>空白组,模型组小鼠相较于空白组显著升高（P<0.05）,艾灸组小鼠相较于模型组蛋白量显著降低（P<0.05）;与空白组相比,模型组TLR4显著升高（P<0.05）,艾灸组与模型组之间没有显著差异（P>0.05）;各组小鼠海马IL-1β、c-fos含量,与空白组比较,模型组小鼠显著升高（P<0.05）,与模型组相比,艾灸组小鼠相较于模型组蛋白量显著降低（P<0.05）。免疫组化结果:对各组小鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、TLR4、IL-1β、c-fos表达的积分光密度（IOD）进行比较,由高到低依次是模型组>空白组>艾灸组,与空白组相比,模型组IOD值显著升高（P<0.05）;与模型组相比,经过8周艾灸干预后,艾灸组IOD值显著降低（P<0.05）。4.艾烟与香烟干预对APP/PS1小鼠影响的对比:①各组小鼠海马刚果红染色显示,模型组与香烟组可见大量橘红色Aβ沉淀颗粒,香烟组细胞排列散乱不规则,可见较多空隙,细胞凋亡坏死严重;艾烟组可见散在Aβ沉积颗粒,细胞排列较整齐,偶见神经元缺失造成的空隙。②Western blot检测结果进行比较,由高到低依次是香烟组>模型组>艾烟组>空白组,与模型组相比,香烟组NLRP3、TLR4显著升高（P<0.05）,Caspase-1、IL-1β差异不显著（P>0.05）;艾烟组小鼠相较于模型组和香烟组NLRP3、Caspase-1、TLR4、IL-1β均显著降低（P<0.05）。③免疫组化IOD值进行比较,由高到低依次是香烟组>模型组>艾烟组>空白组,与空白组相比,模型组和香烟组NLRP3、Caspase-1、TLR4、IL-1β均显著升高（P<0.05）;艾烟组小鼠相较于模型组和香烟组IOD值均显著降低（P<0.05）。④ELISA法测各组小鼠血清结果显示,模型组、香烟组较空白组TNF-α、IL-8、CRP显著升高（P<0.05）,艾烟组与香烟组相比,TNF-α、IL-8、CRP均显著下降（P<0.05）。结论1.艾灸可有效改善AD模型小鼠学习记忆能力和情绪异常,减少Aβ沉积,使小胶质细胞活化得到抑制,促进具有抗炎保护神经作用的M2型小胶质细胞极化,提示艾灸可能具有抑制AD脑内神经炎症调控小胶质细胞极化的作用。2.艾灸通过抑制NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,调控上游炎症因子,抑制了炎症级联反应,控制慢性神经炎症,从而起到保护神经的作用。3.与香烟烟雾对比,艾烟干预不会加剧AD病理变化,可以减轻APP/PS1小鼠海马Aβ沉积病理,抑制NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,降低了血清炎症标志物TNF-α、IL-8、CRP的表达水平。