脓毒症是一个世界范围内的医学难题，其发病率不断上升，死亡率高居不下。它是一个涉及大量局部和全身性炎症反应以及凝血溶血等系统的复杂病理综合征，其发病亦涉及诸多环节和机制。以往针对脓毒症有诸多治疗方法，但效果不尽人意。因此，必须寻找一种更理想的治疗手段。 目前，有关细胞因子的基因治疗已成为研究热点之一。脓毒症中炎症因子发生的平衡紊乱使得以其为靶点的脓毒症治疗成为一种更具有吸引力的治疗策略。研究显示，IL-10是一种强有力的抗炎因子，并通过多种途径发挥抗炎作用。感染时过度表达的炎症细胞因子在机体炎症反应的发生和发展中起着重要的决定性作用。IL-10的这种能够抑制炎症细胞因子的特性使其在脓毒症、ARDS、风湿性关节炎和炎症性肠病等炎性疾病中的应用成为可能，并在抑制炎症反应、促进疾病转归中发挥了重要作用。因此，我们亦选择IL-10作为本研究的靶基因，进行针对脓毒症基因治疗的动物体内实验。另外，MSC具有取材方便、多向分化潜能、可植入性以及便于外源基因的转染和调控等优势而成为目前许多基因治疗研究所选用的细胞载体，也为本研究所选用。与以重组腺病毒直接回输体内相比，MSC作为载体可增加组织特异性、减少宿主免疫反应并延长目的基因的表达时间。 本研究中，我们利用具有高转染率的腺病毒介导靶基因rIL-10至rMSC中，随后检测rMSC中外源基因的表达情况，为后续的动物体内实验奠定基础。目的： 1构建载有大鼠白细胞介素10(ratinterleukine-10，rIL-10)重组腺病毒的大鼠骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcellofrat，rMSC)并观察外源基因在细胞中的表达情况。 2为后续的动物体内实验奠定基础，以探讨含有rIL-10的rMSCs对脓毒症的影响。 方法1采用RT-PCR的方法从健康SD大鼠新鲜脾脏组织中提取出的总RNA中克隆rIL-10基因，于HindⅢ/SalⅠ位点亚克隆入腺病毒穿梭载体成为pAdTrack-CMV.rIL-10；PmeⅠ将其线性化后与腺病毒基因组载体pAdEasy-1共转染E.coliBJ5183而同源重组为pAd.rIL-10；再经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行重组腺病毒的包装，利用Westernblotting和RT-PCR的方法鉴定。经反复感染HEK-293对重组腺病毒进行大规模扩增纯化后，获得的病毒滴度为6.0×1010pfu/mL。 2无菌操作下取健康SD大鼠胫骨和腓骨骨干，获得骨髓细胞。利用密度梯度离心法和贴壁法二者结合来分离并体外培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC)，培养至多代并使用流式细胞仪对第三代rMSC进行表型等鉴定。将重组腺病毒感染rMSC并同时做好对照组。细胞分组如下：实验组使用含rIL-10重组腺病毒(Ad.IL-10)感染rMSC(loadedrMSC/rIL-10+)；对照组使用不含rIL-10的重组腺病毒(Ad.GFP)感染rMSC(loadedrMSC/rIL-10-)。用不同的感染倍数(multipleofinfection，m.o.i)的Ad.rIL-10/Ad.GFP感染rMSC，在荧光显微镜下观察感染效率，并用ELISA、RT-PCR和Weaternblot方法检测外源基因rIL-10在rMSC中的表达情况。 结果1采用RT-PCR方法从健康SD大鼠新鲜脾脏组织中提取的总RNA中成功地克隆出rIL-10基因，构建了重组腺病毒Ad.rIL-10，Westernblotting和RT-PCR证实构建成功。大规模扩增并浓缩后，计算病毒滴度为6.0×1010pfu/mL。 2采用密度梯度离心法结合贴壁法原代培养并于体外扩增出rMSCs，高表达CD29，CD105和CD166，不表达CD45。 3重组腺病毒Ad.rIL-10对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率，当MOI200时为70％。用ELISA的方法检测上清中rIL-10的含量高达(136.2±15.62)ng/mL并维持于较高水平两周以上。 4重组腺病毒感染的rMSC可持续高效表达外源基因rIL-10。rIL-10可通过细胞因子网络而发挥其生物学作用。 结论1采用RT-PCR方法从健康SD大鼠新鲜脾脏组织中提取出的总RNA中克隆rIL-10基因，构建出重组腺病毒Ad.rIL-10。经扩增纯化获得病毒滴度为6.0×1010pfu/mL足以进行后续实验。 2联合使用密度梯度离心法和贴壁法进行原代培养并于体外扩增出rMSCs，高表达CD29，CD105和CD166，不表达CD45。方法简便易行，稳定可靠，产量和质量均能够满足实验的需要。 3重组腺病毒Ad.rIL-10对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率，当MOI200时为70％。 4含外源基因rIL-10的rMSCs高效而持久的表达目的基因，是基因治疗良好的细胞载体，尤其是第一代至第四代的rMSCs。 5为后续动物体内实验奠定了重要的基础。