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重寄生是指一种真菌捕食或者寄生另外一种真菌,获取营养,满足自身的生长繁殖;当被捕食的或被寄生的是植物病原真菌,可以抑制病原真菌的生长繁殖,达到生物防治植物真菌病害的效果。由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4，Foc4)侵染引起的香蕉枯萎病(巴拿马病)是目前香蕉产业发展最为严重的限制因子。目前防控枯萎病的方法主要有化学杀菌剂和生物杀菌剂,而化学杀菌剂的大量使用会引发环境和食品质量问题,因此研究利用以生物杀菌剂为主导的综合防控具有重要意义。研究和应用最广泛的真菌杀菌剂是在根际有较强竞争能力的木霉(Trichoderma spp.),因为其能重寄生植物病原真菌,减轻真菌引起的病害;定殖植物根际,活化养分,促进植物生长,并能诱导植物提高对多种植物病原真菌的系统抗性(Induced Systemic Resistance,ISR),提高经济作物产量。目前生产应用中木霉菌剂主要有哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿木霉(Trichoderma virens) 和深绿木霉(Trichoderma atroviride)。但是由于木霉分子生物学研究起步晚,技术难度大,限制了木霉重寄生机理的研究进展。本研究筛选一株具有强重寄生能力的木霉NJAU 4742,分析确定NJAU 4742其在木霉菌中进化分类;通过优化农杆菌介导转化方法,荧光标记NJAU 4742,跟踪其在土壤颗粒、肥料颗粒和植物根际的定殖;再通过构建T-DNA随机插入突变子库,筛选弱寄生能力的突变子,分析T-DNA在NJAU 4742基因组的插入位点,确定插入位点基因的功能;最后,比较NJAU 4742菌丝分泌的代谢组分的抑菌能力差异,结合相关功能基因的敲除与过量表达,确定NJAU 4742重寄生植物病原真菌的重要因子。主要研究结果如下:1.筛选一株对植物病原真菌Foc4、灰葡萄孢菌、交链格孢菌、核盘菌、水稻恶苗病菌、立枯丝核菌和齐整小核菌有强寄生能力的NJAU 4742,通过扫描电子显微镜(Scanning Electronic Microscopy,SEM)观察到NJAU 4742菌丝能够缠绕或者紧贴Foc4菌丝生长。Trypan Blue染色确定NJAU 4742的代谢产物在NJAU 4742菌丝缠绕Foc4菌丝过程中破坏Foc4的菌丝结构。NJAU 4742水溶性代谢产物能够抑制灰葡萄孢菌、交链格孢菌、核盘菌、立枯丝核菌和齐整小核菌的生长,但不能明显抑制Foc4 菌丝延伸;GC-MS分析NJAU 4742挥发性气体的成分,在封闭环境中,3-辛酮、萘、1-甲基萘和1-辛烯-3-酮均能抑制Foc4菌丝生长;测定NJAU 4742的胞外水解酶的特征,确定灭活Foc4菌体能够诱导NJAU 4742分泌几丁质酶、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶。根据NJAU 4742基因cal1、chi18-5和tef1的序列,贝叶斯进化分析,确定NJAU 4742在木霉属中分类位置,区别于模式菌株Trichoderma harzianum CBS 226.95(CBS)的分支。比较NJAU 4742和CBS的重寄生病原真菌的特异性和水溶性代谢产物的抑菌活性,避光条件下,CBS菌丝重寄生Foc4的能力较弱,其菌丝无法覆盖Foc4菌落,其水溶代谢产物抑制活力也弱。结合Biolog代谢谱分析,鉴定NJAU 4742属于Trichoderma guizhouense。2.优化农杆菌介导转化NJAU 4742分生孢子的方法,确立最佳的转化共培养温度、农杆菌与分生孢子共培养的载体和农杆菌类型,该方法被证实适用转化T.aggressivum CPK 375、T.pleuroticola CPK 2104、T.pleurotum CPK 2094和Foc4,并有较高的转化效率。荧光标记NJAU 4742,跟踪其在土壤和有机肥料颗粒表面定殖,利用突变子潮霉素B抗性,平板计数;盆栽实验证明,NJAU 4742能够促进香蕉植株生长,提高抗病能力,并观察到NJAU 4742成功定殖植物根际。3.通过农杆菌介导转化,T-DNA随机插入NJAU 4742,构建突变子库,纯化得到80个突变子,筛选出一株特异突变子,其菌丝不能覆盖Foc4、灰葡萄孢菌和链格孢菌,水溶性代谢产物的抗真菌活性降低。HiTAIL-PCR确定T-DNA插入NJAU 4742基因组中一个金属肽酶基因(编码MEROPS家族M35蛋白酶)的终止子,金属肽酶命名为nmp1。突变子回复突变,恢复野生型具有的重寄生能力。毕赤酵母表达NMP1,大小约18.7 kDa;分析蛋白结构,NMP1含有独特HEXXH motif,结合2个锌离子,另外GTXDXXYG motif结合第三个锌离子。纯化的NMP1不能抑制病原真菌的生长,但对峙平板中,NMP1能部分恢复突变子的重寄生齐整小核菌的能力,增强野生型NJAU 4742重寄生能力。通过实时定量PCR,灭活Foc4菌丝,对峙中感应和接触病原真菌菌丝能够诱导NJAU 4742 nmp1的表达。4.收集NJAU 4742重寄生Foc4菌丝过程中菌丝表面形成的黄色液体,GC-MS分析其中化合物,鉴定为硬脂酸和棕榈酸。硬脂酸和棕榈酸是细胞膜组成成分,说明重寄生过程中,有菌丝被消化。分析液滴酶活,有较高的几丁质酶和蛋白酶,同时能检测出H2O2。比较NJAU 4742粗酶液(Foc4菌丝诱导)、正丁醇提取物(溶解NJAU4742次级代谢产物)和H2O2对Foc4菌丝的抑制效果,确定H2O2有抑制活力。染色研究NJAU 4742菌落对峙Foc4菌落过程中活性氧的变化,NJAU 4742菌丝接触Foc4后,H2O2集聚。荧光定量PCR分析对峙Foc4过程中NJAU 4742的Fe-sod,Mn-sod和Cu/Zn-sod(编码Superoxide Dismutase,SOD,功能是将O2·-氧化成H2O2)表达量提高。碘化丙啶染色表明10mMH2O2处理Foc4萌发的孢子和菌丝,破坏细胞膜结构;PDA平板上,5mM H2O2能够部分抑制立枯丝核菌和齐整小核菌的生长,改变核盘菌、交链格孢菌和Foc4菌落形态。构建敲除nox1(编码NADPH oxidase 1,Nox1)载体,PEG-CaCl2介导转化原生质体,得到410个突变子,通过PCR筛选出一株阳性转化子。转化子△nox1避光下失去野生型强寄生核盘菌、Foc4和齐整小菌核能力,同时伤害应激反应减弱。构建过量表达nox1载体,转化突变子△nox1,恢复野生型NJAU 4742避光条件下强寄生核盘菌、Foc4和齐整小菌核的能力;转化野生型NJAU 4742,定量PCR确定nox1转录水平,转化子较野生NJAU 4742表现出更强的寄生能力。光照下,突变子能够重寄生核盘菌、齐整小菌核菌落、Foc4和灰霉病菌。结论:菌株NJAU 4742有较强的重寄生多种植物病原真菌能力;适应能力强,能在土壤颗粒表面定殖;能利用有机肥料再次发酵,提高NJAU 4742数量级。分析NJAU 4742次级代谢产物中不同组分,确定H2O2是NJAU 4742菌丝破坏Foc4菌丝的最重要的物质;Foc4菌丝体能够诱导分泌水解酶更,裂解菌丝满足NJAU 4742菌丝的生长。