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高原低氧(High altitude hypoxia)和地下低氧(Subterranean hypoxia)是陆栖哺乳动物的两种典型低氧环境的类型,生物在长期进化过程中对各种低氧环境产生了适应与进化,在细胞,形态及分子水平上形成了一系列稳定的低氧适应机制,系统地研究哺乳动物对低氧环境的适应性进化可为低氧调控机制的研究提供基础。青海田鼠(Neodon fuscus)分布于青藏高原海拔3,700 m-4,800 m的高寒草甸,是一种典型的高原地面鼠;棕色田鼠(Lasiopodomysmandarinus)主要分布于我国华北农田,是一种典型的地下鼠;布氏田鼠(L.brandtii)是棕色田鼠的近缘物种,主要生活在海拔约1,000 m的蒙古高原,营地面活动。3种田鼠均属于田鼠亚科(Arvicolinae),亲缘关系较近,是研究高原低氧和地下低氧的良好动物模型。本研究以青海田鼠、棕色田鼠和布氏田鼠为对象,分别对3种田鼠进行不同文库策略的全基因组高通量二代测序,后对测序片段进行组装得到3种田鼠的全基因组序列;通过鉴定全基因组的重复序列,非编码RNA基因,编码基因的结构和功能,全面地注释3种田鼠的基因组序列;通过全基因组序列对3种田鼠进行系统历史进化分析,估计分化时间、进化速率和种群历史;比较青海田鼠和布氏田鼠的基因组序列,研究青海田鼠对高原低氧环境的适应性进化机制,再通过4组高原哺乳动物的基因组序列研究高原哺乳动物的低氧适应性进化;比较棕色田鼠和布氏田鼠的基因组序列,研究棕色田鼠对地下低氧环境的适应性进化机制,再通过4组地下哺乳动物的基因组序列分析地下哺乳动物的低氧适应性进化。主要研究结果分述如下:1.全基因组测序和组装测得青海田鼠385.90 Gb基因组数据,17K-mer预测基因组大小为2.32 Gbp,数据测序深度166.34 ×;组装得到基因组全长为2.24 Gbp,contig N50和scaffold N50分别为45.59 kb、9.52 Mbp;BUSCO和CEGMA评估基因组的完整性分别为 95.60%和 97.18%。测得棕色田鼠324.9 Gb基因组数据,17K-mer预测基因组大小为2.25 Gbp,数据测序深度172.85 ×;组装得到基因组全长为2.15 Gbp,contigN50和scaffold N50分别为51.15 kb、6.15 Mbp;BUSCO和CEGMA评估基因组的完整性分别为 94.70%和 95.97%。测得布氏田鼠470.39 Gb基因组数据,17K-mer预测基因组大小为2.32 Gbp,数据测序深度202.75 ×;组装得到基因组全长为2.23 Gbp,contigN50和scaffold N50分别为50.79 kb、0.68 Mbp;BUSCO和CEGMA评估基因组的完整性分别为 94.50%和 95.16%。2.全基因组注释青海田鼠、棕色田鼠和布氏田鼠注释得到的重复序列占基因组的比例分别为34.99%、33.93%和36.82%;非编码RNA注释结果中3种田鼠的miRNA、tRNA、和snRNA的拷贝数相当,布氏田鼠的rRNA拷贝数较高;3种田鼠编码基因的结构注释结果相对一致,青海田鼠、棕色田鼠和布氏田鼠的编码基因功能注释比例分别为 97.98%(20,319/20,738)、93.27%(19,801/21,229)和 97.66%(20,049/20,530)。3.三种田鼠的系统进化历史在由12个物种单拷贝直系同源基因家族构建的系统进化树中,三种田鼠聚于一支,青海田鼠属于松田鼠属(Neodon),约7.4MYA分化出来,棕色田鼠和布氏田鼠属于毛足田鼠属(Lasiopodomys),约为5.8MYA分开独立成种;12个物种的进化速率整体有显著性差异,其中3种田鼠的进化速率比其他物种快且差异显著,棕色田鼠最快,布氏田鼠次之,青海田鼠第三;青藏高原隆升运动和冰期对3种田鼠的种群历史影响不同,青海田鼠受高原隆升和冰期的双重影响;布氏田鼠受冰期影响大、高原隆升影响小;棕色田鼠受冰期和高原隆升的影响均较小。4.青海田鼠及高原哺乳动物对高原低氧环境的适应性进化分析1)青海田鼠和布氏田鼠发生扩张的基因家族分别为175个和138个,特有的分别为74个和23个,这些基因主要与蛋白质合成相关,且通过HIF-1信号通路的EGF基因促进血管生成;收缩的基因家族分别为981个和705个,丢失的分别为558和457,主要与嗅觉、视觉等感官及代谢有关。青海田鼠和布氏田鼠中普遍发生正选择进化的基因包括MAPK信号通路相关基因和蛋白激酶B,能够调节HIF-1信号通路,富集结果主要与线粒体等与氧调节的能量代谢相关;青海田鼠的正选择基因主要与白介素、辅酶及维生素相关。布氏田鼠的正选择基因主要与免疫功能相关。2)青海田鼠主要通过FGF7基因等调节MAPK信号通路、蛋白激酶B信号,促进HIF-1α的表达,间接调控HIF-1信号通路。青海田鼠还通过CYCS基因与EGF共同调节心血管系统;SERPINE1和多个EIF2家族应答细胞外部刺激;CYCS、CDK1和HSPA9提高有氧呼吸和糖代谢的能力;并且通过关键基因RIPK1、CYCS和IL12B调节多个通路:免疫及神经性疾病、抗癌通路、胞质DNA感受通路、核苷酸切除修复、NF-kB信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路和色氨酸代谢。3)青海田鼠、北美鼠兔、滇金丝猴和牦牛4种不同的高原物种没有共同发生扩张的基因家族,仅有4个共同的正选择基因,其功能包括促进血管生成和重塑厌氧途径。高原物种对高原低氧适应性进化方式并非完全相同,青海田鼠主要通过调控机体的能量代谢,牦牛通过调控糖代谢,北美鼠兔通过DNA修复途径,滇金丝猴通过神经突触相关基因发生正选择进化的方式。5.棕色田鼠及地下哺乳动物对地下低氧环境的适应性进化分析1)棕色田鼠和布氏田鼠发生扩张的基因家族分别为178个和138个,特有的分别为69个和23个,基因主要与蛋白质合成相关,且通过HIF-1信号通路的GAPDH基因提高厌氧代谢降低氧的消耗。收缩的基因家族分别为724个和705个,丢失的则分别为596和457,基因主要与嗅觉、犁鼻器和代谢有关。棕色田鼠和布氏田鼠中普遍发生正选择进化的基因包括CDKN1B、EPO和VHL基因调控HIF-1信号通路中细胞增殖和氧运输能力,富集的功能类别较多,包括线粒体、DNA修复等与低氧适应相关的条目;棕色田鼠的正选择基因包括调节HIF-1信号通路的IL6R和IFNGR2基因,富集结果主要与能量代谢和DNA修复相关。布氏田鼠的正选择基因主要与免疫功能相关。2)棕色田鼠主要通过GAPDH、PRKAG3和PDGFB调节PI3K-Akt和AMPK信号通路,FOXP3,IL7R和CD7调节心血管系统;MDM2和NUP85应答细胞外部的刺激;GAPDH和PEX10提高糖代谢、氧化还原反应和线粒体功能;并且通过关键基因MDM2、CDK2和IL7R调节多个通路:造血细胞谱系,PI3K-Akt信号通路,黑色素瘤,细胞周期,过氧化物酶体和能量代谢相关的通路。3)金毛鼹、星鼻鼹、盲鼹形鼠和滨鼠科的2个物种(达马拉鼹鼠和裸鼹鼠)没有共同发生扩张和正选择进化的基因。但4种地下哺乳动物比近缘物种有更多扩张的基因与免疫功能相关,且均在视觉方面发生正选择进化。在低氧适应方面,金毛鼹、盲鼹形鼠和滨鼠科有更多的基因发生了扩张,金毛鼹、星鼻鼹和盲鼹形鼠均通过能量代谢和DNA修复相关的基因发生了正选择进化,还有其他物种特异性的方式可能与土壤环境、气候及生活习性的差异有关:星鼻鼹调节其呼吸系统,盲鼹形鼠调节其氧化应激反应,滨鼠科2个物种调节其HIF-1信号通路。主要结论如下:1)经二代基因组测序、denovo组装的青海田鼠、棕色田鼠和布氏田鼠基因组序列长度分别是2.24 Gbp、2.15 Gbp和2.23 Gbp,其中分别有34.99%、33.93%和36.82%的重复序列,4类非编码RNA,编码基因个数分别为20,738、21,229和 20,530。2)青藏高原隆升运动与冰期对3种田鼠的种群历史影响不同,青海田鼠受高原隆升和冰期的双重影响;布氏田鼠受冰期影响大、高原隆升影响小;棕色田鼠受冰期和高原隆升的影响均较小。3)青海田鼠与棕色田鼠对各自不同的低氧环境进化形成了特定响应机制。①在调控HIF-1信号通路方面,青海田鼠主要通过FGF7等基因调节MAPK信号通路、蛋白激酶B信号,间接促进ZHIF-1α的表达,且经通路中EGF基因的扩张促进血管生成;棕色田鼠通过基因VLH、IL6R和IFNGR2直接调控HIF-1α的表达,且经通路中CDKN1B基因调节细胞增殖,EPO基因调节氧运输能力,GAPDH基因扩张提高了厌氧代谢降低氧消耗。②在其他通路调节方面,青海田鼠主要通过RIPK1、CYCS和IL12B基因调节免疫及神经性疾病、抗癌通路、胞质DNA感受通路、核苷酸切除修复和色氨酸代谢通路;棕色田鼠主要通过MDM2、CDK2和IL7R基因调节造血细胞谱系,黑色素瘤,细胞周期,过氧化物酶体和与能量代谢相关的通路。③在其他调控系统方面,青海田鼠主要通过CYCS与EGF、棕色田鼠主要通过FOXP3、IL7R和CD7,共同调节心血管系统;青海田鼠通过SERPINE1和多个EIF2家族、棕色田鼠通过MDM2和NUP85应答细胞外部的刺激;青海田鼠主要通过CYCS、CDK1和HSPA9提高有氧呼吸和糖代谢的能力;棕色田鼠通过GAPDH和PEX10提高糖代谢、氧化还原反应和线粒体功能。4)高原物种对高原低氧适应性进化方式具有物种特异性;地下哺乳动物是通过功能相同或相近的正选择基因对地下低氧环境发生适应性进化,而非基因结构本身。总之,我们的研究发现,青海田鼠和棕色田鼠分别通过间接和直接的方式调控HIF-1信号通路,进而调控心血管系统、应激反应和能量代谢对各自低氧环境发生适应性进化,这表明亲缘关系较近的物种对于低氧环境适应性进化的一致性。