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GLP-2是胰高血糖素原基因(proglucagon)在肠上皮组织中由L内分泌细胞表达翻译后的处理加工的产物之一,它作为一个促肠黏膜生长修复物质,通过促进绒毛的高度和隐窝深度的增长,从而增加肠道营养吸收的面积,同时GLP-2能恢复和维持小肠黏膜上皮屏障的完整性,促进小肠损伤后的修复等作用。
为获得高效稳定表达的猪GLP-2蛋白,应用DNASTAR(Version5.0)基因分析软件,参照NCBI GenBank上登录猪GLP-2核苷酸序列(ID:NP-999489),利用毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,选择高表达密码子重新设计合成新的GLP-2核苷酸序列同时将猪GLP-2的第二个丙氨酸变成甘氨酸。保持了猪GLP-2的基因序列氨基酸顺序不变,因此表达的蛋白质不发生改变,活性不变。通过全基因合成改造后的GLP-2基因片段。基因克隆到pPICZaC质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pPICZaC-GLP-2。送公司测序鉴定,结果显示重新设计合成的目的基因正确插入pPICZaC.
重组表达载体pPICZaC-GLP-2通过限制性内切酶SacI酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33内。经ZeocinTM抗性选择培养基筛选,置28℃温箱培养3～4d,结果获得多个单个菌落,通过提高抗生素浓度得到高拷贝转化子,PCR检测GLP-2基因与毕赤酵母染色体稳定结合。进行诱导表达,每24h添加一次甲醇,保持终浓度为1.0％。在AOX(醇氧化酶)的启动下,菌体前24h在BMGY中快速繁殖,24h后离心,将菌体浓缩在BMMY得到分泌诱导表达。4d后,收集菌液,离心,取上清。诱导表达产物取少量上清液进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析,可见相对分子量约为3.9 kD的GLP-2蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为75.0 mg/L。
以昆明种小鼠为对象,初步研究了注射20μg/mL实验组小鼠的肠绒毛高度与空白对照组肠绒毛高度差异极显著(P＜0.01),而与空载体对照组肠绒毛高度差异显著(0.01＜P＜0.05),但其他实验组之间差异均不显著(P＞0.05),表明GLP-2在体内具有一定的生物活性。
综上所述,本研究成功地应用基因工程和蛋白质工程技术表达了GLP-2,该蛋白在体内具有生物活性,为GLP-2的工业化生产和在畜牧养殖业中的应用奠定一定的基础。