【背景】肝细胞肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,是世界第三位、我国第二位的肿瘤相关性死亡原因。近年来,尽管外科手术技术不断提高、现代影像技术和非手术局部治疗技术不断进步,大大提高了肝癌的治疗效果,然而,肝癌患者的预后并没有因此得到很大的改善。主要原因是肝癌早期诊断困难、容易发生复发和转移等。因此,深入研究肝癌发生、发展的分子机制,以期寻找能够用于肝癌早期诊断的分子标志物以及寻找有效治疗肝癌的新靶点是一项亟待解决的问题。micro RNA是一类非编码小RNA,主要通过与靶基因m RNA 3’非编码区相互结合进而负向调控靶基因的表达,从而参与多种细胞学功能,包括细胞增殖、凋亡、分化、代谢和调节内分泌系统等。mi RNA表达异常和包括肿瘤在内的多种疾病相关。在肿瘤的研究中发现,mi RNA参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、耐药和侵袭转移等多个方面的调控,其中,mi R-150在肿瘤的发生发展过程中也发挥了重要作用。在结肠癌、胰腺癌、卵巢癌中mi R-150表达下调,发挥抑癌作用,而在胃癌、乳腺癌中mi R-150高表达,促进肿瘤的进展。因此,mi R-150在不同的肿瘤类型中发挥着不同的作用。有研究表明,通过基因芯片分析CD133+和CD133-的肝癌细胞中micro RNA的表达差异发现,mi R-150在CD133+的肝癌干细胞中表达下调。另有一篇文献报道,通过比较肝癌转移灶和原位肝癌中的micro RNA表达差异,发现mi R-150在转移灶中表达下调,推测mi R-150可能参与了肝癌的侵袭转移过程。然而,mi R-150是否参与调控了肝癌的发生、发展过程?其在肝癌中的具体作用及机制是什么?至今尚不明确,仍待进一步研究。【目的】1、检测肝癌组织和对应癌旁组织中mi R-150的表达,分析mi R-150表达水平与患者临床病理特征及患者预后之间的关系。2、研究mi R-150对肝癌细胞增殖和侵袭转移能力的影响。3、探讨mi R-150调控肝癌细胞恶性表型的分子机制。【方法】1、通过荧光实时定量PCR方法检测mi R-150在84对肝癌组织和对应癌旁组织中的表达情况,分析mi R-150的表达和肝癌患者临床病理特征以及患者预后之间的关系。2、构建mi R-150过表达慢病毒载体,感染mi R-150表达相对较低的肝癌细胞系,建立稳定表达mi R-150和对照NC的肝癌细胞。通过CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤实验检测mi R-150对肝癌细胞增殖能力的影响;通过Transwell侵袭、迁移实验和裸鼠肺转移模型实验检测mi R-150对肝癌细胞侵袭、转移能力的影响。3、通过生物信息学软件预测mi R-150的下游靶基因,经综合分析,筛选GAB1可能是mi R-150的直接靶基因之一。通过双荧光素酶报告基因实验、荧光实时定量PCR和western blot实验进行验证。检测肝癌组织中GAB1的表达,分析其与mi R-150表达水平的相关性。采用RNAi技术沉默肝癌细胞中GAB1的表达,观察其对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响,过表达GAB1后观察肝癌细胞的功能恢复情况。进一步通过western blot和免疫组织化学染色方法检测mi R-150对GAB1表达水平、ERK1/2磷酸化水平和EMT标志物蛋白表达水平的影响,深入研究其中的分子机制。【结果】1、mi R-150在肝癌组织中的表达水平显著低于对应癌旁组织,结合肝癌患者临床病理资料分析,mi R-150低表达与肿瘤大小、静脉侵犯和转移密切相关。进一步研究发现,mi R-150低表达组患者的总体生存时间显著低于mi R-150高表达组患者。低mi R-150表达能够作为肝癌患者预后较差的独立指标。2、mi R-150在肝癌细胞系中的表达水平显著低于永生化人肝细胞系HL-7702,选用mi R-150表达相对较低的SMMC-7721和MHCC97-H细胞用于后续实验。成功构建mi R-150过表达慢病毒载体后,感染细胞,构建过表达mi R-150的肝癌细胞系。CCK-8实验、平板克隆实验、裸鼠皮下成瘤实验结果显示,过表达mi R-150能够显著抑制肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和裸鼠皮下成瘤能力。3、Transwell实验证实,过表达mi R-150能够显著抑制肝癌细胞的侵袭、迁移能力。裸鼠体内实验结果显示,过表达mi R-150能够显著抑制肝癌细胞的肺转移能力。4、通过生物信息学软件预测,GAB1可能是mi R-150的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,野生型GAB1-WT-3’UTR报告基因载体与mi R-150 mimic共转染可使荧光素酶活性显著降低,而mi R-150 mimic与突变型GAB1-MUT-3’UTR共转染后荧光素酶活性无明显改变。进一步实验证实,过表达mi R-150能够显著降低GAB1m RNA和蛋白表达水平。在肝癌组织中GAB1 m RNA表达上调,通过分析发现肝癌组织中mi R-150表达和GAB1 m RNA表达呈负相关关系。表明GAB1是mi R-150的直接靶基因。5、GAB1-si RNA下调GAB1表达能够抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,模拟了mi R-150过表达对肝癌细胞的抑制作用,而恢复GAB1的表达后,部分逆转了mi R-150的抑制作用。6、western blot实验表明,过表达mi R-150抑制肝癌细胞GAB1表达的同时还抑制了ERK1/2的磷酸化,并且上调上皮样细胞分子标记物E-cadherin蛋白的表达,下调间质样细胞分子标记物N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,提示过表达mi R-150能够抑制肝癌细胞的EMT过程。最后在裸鼠移植瘤组织水平验证了过表达mi R-150能够抑制GAB1的表达和ERK1/2的磷酸化。【结论】1、mi R-150在肝癌组织中低表达,并且mi R-150低表达和肝癌的恶性表型以及患者预后密切相关。2、过表达mi R-150能够在体外和体内水平抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。3、GAB1是mi R-150的直接靶基因,mi R-150通过负性调节GAB1-ERK1/2轴抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、转移能力。临床标本进一步证实mi R-150的表达水平与GAB1 m RNA表达水平呈负相关关系。因此,mi R-150-GAB1-ERK1/2轴有可能成为肝癌治疗的新靶点。