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冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是一种有包膜的单股正链RNA病毒,其属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)成员。冠状病毒广泛分布于人、哺乳动物等宿主中,具有跨种属传播的能力,感染宿主后主要引起呼吸系统疾病,部分宿主出现神经系统疾病。人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒 229E(HCoV-229E)、人冠状病毒 OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)引起的呼吸道疾病症状较轻,而严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)以及2019年底开始暴发的新冠状病毒(SARS-CoV-2)等3种动物源性病毒则对人类的生命安全造成了极大的影响,冠状病毒也因此引起了世人广泛的关注。但是,人们对冠状病毒在宿主体内的感染过程、复制机制知之甚少。目前尚无特效的药物能够治疗人冠状病毒所导致的疾病,多种对冠状病毒有抑制作用的药物在体内的疗效还需要验证,其抗病毒机制还需要进一步探究。体外筛选的抗冠状病毒药物的疗效首先需要在动物模型中得到验证,但传统的动物实验耗时较长、结果不够直观,而且SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2的相关实验必须在BSL-3实验室中进行,操作繁琐复杂、危险性高。与上述三种高致病性病毒具有相似的基因组结构并同属于p群的HCoV-OC43 和鼠肝炎病毒 1 性(Mouse hepatitis virusl,MHV-1)可以在 BSL-2实验室中操作,且能够在相应的动物模型的呼吸系统和神经系统中有效复制,结合新的检测技术后便可成为验证抗病毒药物体内效果的有效工具。更重要的是筛选获得的抗病毒药物的机制同样需要阐释,这样才能够为临床用药和研发新的药物提供理论指导。本研究采用带有Rluc标签的HCoV-OC43病毒,结合活体成像技术,在BALB/c小鼠中构建了人冠状病毒感染的可视化小鼠模型。同时,采用干扰素受体缺失的小鼠中构建了能够造成肺部病理损伤的冠状病毒感染小鼠模型。同时利用上述模型和已有的MHV-1感染小鼠模型评价了部分广谱抗冠状病毒抑制剂体内效果,进一步探究了广谱抗冠状病毒药物吐根碱的抗病毒机制。具体内容和研究结果总结如下:1可视化的HCoV-OC43感染小鼠模型的建立及应用rOC43-ns2DelRluc感染BALB/c和C57BL/6两个品系的乳鼠后可在体内有效复制,并造成小鼠明显的神经症状,最终致死。活体成像结果表明,荧光信号只能在BALB/c乳鼠的脑组织和脊髓中被检测到。同时比对病毒滴度与荧光信号强度表明,荧光信号强度与病毒滴度呈正相关,尤其是颅内注射组的关联性最强。已报道的抗HCoV-OC43药物氯喹(chloroquine)能够有效抑制病毒的复制、减弱荧光信号;本实验室已筛选获得的多种广谱抗冠状病毒抑制剂的体内评价表明石蒜碱(lycorine)也能够有效抑制HCoV-OC43的复制,说明这一模型能够可视化的反映出冠状病毒感染导致的神经症状并应用于广谱抗冠状病毒抑制剂的体内评价。2 HCoV-OC43感染IFNαR-/-小鼠模型的构建及其应用3周龄的干扰素受体缺失(IFNαR-/-)的小鼠经滴鼻感染rOC43-ns2DelRluc后,可以在脑组织、肺组织中检测到病毒的复制。相比于野生型C57BL/6小鼠,IFNαR-/-的小鼠脑组织、肺组织中病毒滴度更高,病毒在感染后第六天时达到高峰,随后被逐渐清除掉。病理学切片结果显示小鼠感染病毒后肺组织出现肺泡破裂、单核细胞聚集等典型的病理变化,免疫组化结果表明这些病理改变是由rOC43-ns2DelRluc病毒感染造成的,而普通C57BL/6小鼠的肺组织中则无上述病理改变。利用已报道的HCoV-OC43抑制药物氯喹能够有效降低IFNαR-/-小鼠脑组织、肺组织中HCoV-OC43滴度,同时抑制病毒对肺组织造成的病理损伤。对本实验室前期筛选获得的多种广谱抗冠状病毒抑制剂进行的体内评价表明石蒜碱(lycorine)能够有效抑制HCoV-OC43的复制并抑制病毒对肺组织的病理损伤,表明这一模型能够用于评估抗冠状病毒抑制剂对肺组织病理损伤的改善。3 MHV-1感染A/J小鼠模型在冠状病毒广谱抑制剂体内评价中的应用此前文章报道MHV-1在感染A/J小鼠后第三天时病毒滴度最高,利用MHV-1感染A/J小鼠的模型去评估本实验室筛选获得的多种具有广谱抗冠状病毒活性的抑制剂。不同抑制剂治疗后第3天时检测脑组织、肺组织、肝脏、脾脏中的病毒滴度,实验结果表明吐根碱能够有效抑制MHV-1在A/J小鼠体内的复制。4冠状病毒广谱抑制剂吐根碱抗病毒分子机制探究初步实验表明吐根碱抑制冠状病毒复制主要在病毒复制周期的早期发挥作用,即可能在吸附、进入、病毒蛋白的表达与基因组复制阶段发挥作用,逐一验证后结果表明:吐根碱对冠状病毒的吸附没有影响;吐根碱能够有效阻断MERS-CoV和HCoV-NL63进入细胞,其阻断MERS-CoV冠状病毒进入的机制在于吐根碱阻断了 MERS-CoV冠状病毒S蛋白吸附受体后诱导的膜融合过程;同时吐根碱能够广谱的抑制冠状病毒的复制,其机制在于吐根碱阻断了病毒基因组附着于核糖体进行翻译的过程,从而抑制了病毒蛋白的表达及基因组的复制,这可能是吐根碱具有广谱抗冠状病毒活性的分子机制。综上所述,本研究采用带有Rluc标签的HCoV-OC43病毒,结合活体成像技术,在普通小鼠中构建了能够反应冠状病毒神经嗜性的可视化小鼠模型,并在基因改造的小鼠中构建了能够造成肺组织病理损伤的小鼠模型。同时利用上述模型和已有的MHV-1感染小鼠模型验证了部分广谱抗病毒抑制剂(氯喹、石蒜碱、吐根碱)体内效果。最后探究了广谱抗冠状病毒抑制剂吐根碱的抗病毒分子机制。